结核分枝杆菌最常用的检测方法是涂片法，痰涂片是一种快速低廉、操作简便、被临床广泛应用的方法，但该方法无法区分死菌和活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低。结核菌培养阳性是诊断结核的金标准，与痰涂片相比，培养法虽然灵敏度增加不少，但检测周期太长，不但贻误治疗，也增加了传播时间。结核分枝杆菌抗原阳性可作为结核感染的直接证据，且不受结核病患者免疫状态的影响。由于单克隆抗体制备技术的发展，目前已可制备高效价的特异性抗体，使检测血清中的结核分枝杆菌抗原成为结核诊断的新方法。

结核菌素试验是检测机体对结核分枝杆菌免疫反应的经典方法，具有操作简便、价格便宜的优点，但试验结果受卡介苗接种及人体免疫状态的影响，在严重播散性结核病和免疫抑制儿童患儿中常出现假阴性。γ- 干扰素释放试验是通过检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激T 细胞产生的γ-干扰素来判断是否存在结核分枝杆菌感染；特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌的干扰，且使用外周血标本进行检测不接触活菌，减少了人员感染的风险。但γ-干扰素释放试验不能很好区分是活动性结核与陈旧性结核。

实时荧光PCR法检测结核分枝杆菌核酸，可提升结核分枝杆菌的检出率，准确率和敏感度均较高，结果与分离培养法检测结果有较高的一致性。以RNA为检测靶标的检测技术方法使用16SrRNA为靶标，其灵敏度和特异度很高，是目前市场上唯一可以区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的分子生物学检测方法。

GeneXpert是一种全自动化分子诊断系统，是以结核分枝杆菌的RNA聚合酶活性位点编码区为靶标，采用半巢式实时半定量 PCR 进行病原体检测的方法。对于临床疑似肺结核患儿、耐多药肺结核患儿，GeneXpert可先于抗酸染色或细菌培养作为初筛方法。目前，GeneXpert技术用于检测结核分枝杆菌主要为结核分枝杆菌复合群快速分子鉴定及利福平耐药性检测（GeneXpert MTB/RIF），GeneXpert MTB/RIF是通过检测结核分枝杆菌基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现结核分枝杆菌核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。它具有以下优势：特异性好，能准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌；灵敏度高，检测快速，仅需要2h就完成检查了，适用于各种标本，如痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高。   

GeneXpert MTB/RIF还可以应用于肺外结核及儿童结核的诊断，但不足的是该系统的设备和试剂盒成本均较高，故短期内是无法实现其在基层结核病实验室及医疗机构进行普及使用。

可引起肺部真菌感染的病原体种类较多，比较常见的包括隐球菌属、曲霉属、毛霉属、肺孢子菌属等。显微镜检法检测真菌操作简便、快速，不需要特殊仪器设备，适合在各级实验室开展，但灵敏度相对较低， 病原菌数量少时难以发现，且需要临床人员有一定的临床检验工作经验。分离培养是诊断真菌感染的金标准，但部分真菌培养困难，如毛霉目，有时显微镜检可见大量菌丝，但培养阳性率不高，特别是呼吸道标本处理不当常导致毛霉目真菌菌体被损坏，生长困难。另外，曲霉属与毛霉目真菌在周围环境中可见，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植。因此，对培养阳性者应结合临床以区分真菌感染、环境污染及呼吸道定植。

肺部真菌感染常用的免疫学诊断试验包括1,3-β-D葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖抗原试验、曲霉免疫球蛋白G抗体试验、隐球菌荚膜多糖抗原试验等。G试验可检测隐球菌和接合菌以外的真菌，阴性结果意义较大，可排除判断未发生隐球菌和接合菌以外的真菌感染；但受饮食、药物如白蛋白、抗菌药物等影响较大，易出现假阳性，需根据临床情况进行判定。半乳甘露聚糖抗原试验主要用于辅助诊断侵袭性肺曲霉病，在中性粒细胞缺乏患者中易出现假阴性。隐球菌荚膜多糖抗原试验在诊断隐球菌感染中具有极重要的价值，对于肺隐球菌病，支气管肺泡灌洗液的隐球菌抗原检测有高度的特异度和敏感度。曲霉免疫球蛋白G抗体试验在超敏反应性支气管肺曲霉病与慢性肺曲霉病诊断中有较好的应用价值。目前最常见的检测真菌感染的分子生物学方法是PCR，但其在真菌检测中的应用相对较少，主要原因在于真菌的细胞壁较厚，常规方法下核酸提取困难。近年来，宏基因组二代测序的出现及临床应用为肺部真菌感染的诊断提供了非常重要的手段，使临床诊断下呼吸道真菌感染的方法更加丰富，具有重要的临床价值。

宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）技术是近年来兴起的非序列依赖的新型核酸检测方法，由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。mNGS 无需事先对样本进行特异性扩增，且能够无偏倚地在同一样本中同时检测已知或者未知的细菌、真菌、寄生虫和病毒，还能明确微生物的抗生素耐药情况。在未知病原菌的感染性疾病暴发调查、传统检测结果阴性的感染患者、免疫缺陷患者及危重症感染患者的应用中均已证明了mNGS的独特优势。可检测的标本包括血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液等。与传统检测技术比较，mNGS对标本选择不具有偏向性，且灵敏度特异度高、通量高，可有效发现新发病原，实现精准诊断。对于儿童呼吸道感染，在病因不明且病情危重需要尽快明确病原体、疑似新发或特殊病原体感染、传统微生物检测技术多次阴性且治疗效果不佳等情况下，可以在常规病原检测的同时或在其基础上对样本进行mNGS分析，以高效获取感染病原体的信息。在检出细菌及真菌方面，肺泡灌洗液标本具有更高的敏感性，而在检测病毒方面，外周血标本检出率更高，腺病毒肺泡灌洗液和血mNGS同时可以检出。但由于mNGS 操作程序复杂，对环境和人员要求较高，难以在基层实验室开展，且检测成本高，不推荐作为常规检测项目，主要用于重症感染、难以治愈的慢性感染、复杂/混合感染和免疫缺陷患儿感染的诊断。另外，mNGS检测过程混杂因素较多，不同的方法、平台、质控都可能影响结果，标准流程有待统一。   

综上所述，传统呼吸道病原体检测手段如培养、涂片因敏感性和时效性差，不利于呼吸系统感染性疾病早期临床诊断和治疗。呼吸道感染病原体抗原或抗体检测的多联检测时效性高，可用于早识别感染，并指导抗感染药物的合理使用。快速分子检测的发展在很大程度上有助于加快呼吸系统感染性疾病的诊断，是对传统培养方法的有效补充，但不能完全替代传统培养方法。mNGS 检测对呼吸道病原体的早期发现，特别是疑难、急危重症及混合感染诊断等方面具有明显的优势。

在临床应用上，可以将传统的涂片、培养、抗原、抗体等检测方法与分子检测方法相结合，发挥优势互补，从而快速、准确识别呼吸道病原体、指导临床治疗。

李小玲，祁媛媛，张晓波^*（复旦大学附属儿科医院 呼吸科，上海 201102）

本文转发自中国临床医生杂志