肾上腺皮质功能减退的诊断及病因鉴别应结合病史、临床表现、实验室检查、功能试验等综合评估。

血清皮质醇：一般于清晨8时空腹采血测定血清皮质醇。非应激情况下，血清皮质醇<3 μg/dL(80 nmol/L)，应高度怀疑肾上腺皮质功能减退；血清皮质醇>18 μg/dL(500 nmol/L)，可以排除肾上腺皮质功能减退诊断；需要注意部分肾上腺皮质功能减退患者基础血清皮质醇可在正常范围。急性危重疾病状态下，血清皮质醇在正常范围不能排除肾上腺皮质功能减退。

血浆ACTH：原发性肾上腺皮质功能减退一般基础血浆ACTH>22 pmol/L(100 pg/ml)(或>参考值范围上限2倍)，继发性肾上腺皮质功能减退血浆ACTH水平降低或在正常范围低限。因此，血浆ACTH正常有助于排除原发性肾上腺皮质功能减退。

血醛固酮、肾素：原发性肾上腺皮质功能减退血醛固酮低于正常，而血浆肾素活性(PRA)升高。继发性肾上腺皮质功能减退血醛固酮水平正常。

尿游离皮质醇(UFC)、尿17-羟皮质类固醇醇(17-OHCS)和17-酮类固醇：常低于正常值。

目前最为常用的激发试验方法为标准ACTH兴奋试验，其他试验还包括：小剂量ACTH兴奋试验、连续性ACTH兴奋试验、胰岛素低血糖兴奋试验等。需要注意，国内外指南均推荐ACTH1-24作为激发试验常规药物，但由于国内缺乏此品种，仅有ACTH1-39作为替代。ACTH1-39是天然的促肾上腺皮质激素，其免疫原性较高、不良反应大，仅限肌注或稀释后缓慢静滴，因此临床需权衡使用。

标准ACTH兴奋试验：正常个体肌注或静注250 μg ACTH1-24，分别于0、30和60 min测血清皮质醇，30或60 min血清皮质醇峰值>18 μg/dL(500 nmol/L)。原发性肾上腺皮质功能减退血清皮质醇无变化或仅略上升，但轻型或初发的继发性肾上腺皮质功能减退可能呈现正常反应，因此，标准ACTH兴奋试验只能排除原发性肾上腺皮质功能减退。

小剂量ACTH兴奋试验：正常个体静脉注射1 μg ACTH1-24，分别于0、30和60 min测血清皮质醇，30或60 min血清皮质醇峰值>18 μg/dL(500 nmol/L)。原发性和继发性肾上腺皮质功能减退则不上升。既往研究认为该试验在诊断轻型或初发的继发性肾上腺皮质功能减退时更为敏感，但因其存在药物剂量小、配制烦琐、易呈现假阳性等缺点，仅推荐当ACTH1-24供应短缺时使用。

连续性ACTH兴奋试验：该试验有利于更好地将原发性肾上腺皮质功能减退与继发性肾上腺皮质功能减退进行鉴别。将250 μg ACTH1-24或25单位ACTH1-39溶于500 mL生理盐水后持续静滴8 h，共3~5 d，每日测血清皮质醇、UFC、17-OHCS。若3~5 d后UFC<200 μg/24 h(0.55 μmol/24 h)或17-OHCS<10 mg/24 h(27.6 μmol/24 h)，则支持原发性肾上腺皮质功能减退，继发性ACI常呈延迟反应。

胰岛素低血糖兴奋试验(ITT)：该试验被认为是判断可疑继发性肾上腺皮质功能减退的金标准。但因该试验有较高风险，不建议用于老年人、心脑血管疾病、癫痫及已有低血糖的患者。常规ITT方法：静脉注射胰岛素0.1~0.15 IU/kg后，于0、30、60和120 min测血清皮质醇和血浆ACTH，正常反应为兴奋后血清皮质醇峰值>18 μg/dL(500 nmol/L)，而继发性肾上腺皮质功能减退血清皮质醇和血浆ACTH不上升。需要注意该试验血糖应低于2.2 mmol/L(或血糖<2.6 mmol/L且低于基础值的50%)，才能保证试验结果的可靠性；用药后45 min若最低血糖未满足上述条件，需要追加胰岛素(0.3 IU/kg)再次激发，并重新记录激发时间。

近年来，因常规ITT方法诱发低血糖成功率较低，上海瑞金医院团队研究出ITT胰岛素注射剂量校正方法，即先通过口服糖耐量试验，测定0、30、60、120和180 min的血糖及血清胰岛素水平，再按照以下公式校正：胰岛素注射剂量(IU)＝体重×{-0.034+0.000 176×[0.5×(空腹胰岛素+180 min胰岛素)+60 min胰岛素+120 min胰岛素]+0.009 846×体重指数}。若用药后45 min内未激发低血糖，则需追加上述胰岛素注射剂量的2倍，并重新记录激发时间。