200
评论
查看更多
密码过期或已经不安全，请修改密码
修改密码
壹生身份认证协议书
同意
拒绝
同意
拒绝
同意
不同意并跳过
靶向高通量测序（tNGS）技术通过设计特异性引物或捕获探针，靶向检测临床标本中的病原体及其耐药基因，为感染性疾病的诊疗、监测提供证据。然而当前tNGS和宏基因组高通量测序（mNGS）临床应用场景不明确，且不同厂家tNGS技术体系差异大，结果良莠不齐，在临床适应证、实验流程、质量控制、性能验证和报告解读等方面缺乏共识和标准。为了更好指导我国tNGS的临床实践，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会邀请微生物学、感染病学、呼吸病学、流行病学等领域的专家共同研讨和参与制订《靶向高通量测序在感染性疾病中应用与实践专家共识》。本指南系统归纳了国内外tNGS在感染性疾病中的研究，提出符合我国临床实践的推荐意见，主要内容包括：共识制订过程、临床适应证、技术要点、湿实验与干实验、报告发放与解读和报告模板，以期规范tNGS在感染性疾病中的应用和实践。
高通量测序（NGS）技术为临床感染性疾病提供了高通量检测技术手段，主要包括宏基因组高通量测序（mNGS）、靶向高通量测序（tNGS）和全基因组测序（WGS）。tNGS和mNGS通量高，可一次性检测百种以上病原。两者不同之处在于，mNGS为鸟枪法测序，无需预设待检病原，但易受人源背景干扰。而tNGS通过特异性引物扩增或者杂交捕获的方式靶向富集目标病原体或基因，测序量仅为mNGS百分之一，成本低且同一流程可检测DNA和RNA病原。
tNGS按照技术路线可分为多重PCR扩增法和探针捕获法。多重PCR扩增法通过设计特异性引物进行超多重PCR扩增富集目标病原体的靶核苷酸序列，而探针捕获法则通过探针杂交捕获的方式进行富集。多重PCR扩增法比探针捕获法成本更低且速度更快，工作流程更简单，起始量要求更少，但覆盖的靶病原体不如探针捕获法多。探针捕获的靶区范围更广，使用随机打断的文库构建方式使文库片段多样性比多重PCR扩增法更高，显著减少PCR冗余扩增导致的完全重复序列。尽管tNGS已用于病原检测，但临床适应证不明确，检测质量参差不齐，检测报告不规范，临床解读困难。因此，制订旨在规范临床适应证、送检要求、tNGS检测流程、报告发放和结果判读的共识，可为感染性疾病的病原学诊断提供重要依据。为此，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会邀请微生物学检验、感染病学、呼吸病学、流行病学等领域的专家共同参与制订本共识，以助力tNGS的规范化应用。tNGS与mNGS在术语、检测流程等一致之处，本共识不再赘述，具体可参考mNGS相关团体标准和专家共识。
目前，tNGS可用于如下3类场景：感染性疾病病原体检测、耐药基因检测、公共卫生流行病学病原监测。
临床应充分了解并选用合理设计的tNGS技术，不同类型感染，例如呼吸道感染、中枢神经系统感染等常见病原谱不同，因此tNGS微生物靶标设计应充分考虑感染性疾病症候群的流行病学数据，涵盖该症候群临床常见病原体，不建议纳入某症候群中无临床意义的微生物。目前，tNGS可以作为重要的辅助诊断手段，但不能单独作为确诊或排除的证据。
共识1：tNGS的应用场景应与mNGS有所区别和侧重。对于非重症患者，传统微生物学检测阴性时，考虑送检tNGS；病情危重或新发突发传染病时，考虑送检mNGS。
共识2：针对不同的感染部位，建议覆盖相应病原谱的tNGS，比如肺部感染组套、中枢神经系统感染组套等。靶向病原谱应包括该症候群难培养、罕见的病原，不宜纳入该部位无临床意义的微生物。
共识3：tNGS结果阴性而临床仍高度怀疑感染时，考虑送检mNGS。
共识4：建议根据临床需求和医疗花费选择不同tNGS方法。多重PCR扩增tNGS方法靶标少，花费较低，而探针捕获tNGS方法覆盖病原谱广，花费较高。
共识5：临床高度怀疑结核分枝杆菌感染或抗酸染色阳性需鉴别非结核分枝杆菌（NTM）感染时，考虑选用包括结核分枝杆菌复合群及致病性NTM的tNGS。
mNGS常规数据量对耐药基因检测存在局限性，随机测序的方案仅在高浓度时可稳定检出耐药基因，尤其对于水解酶等耐药机制，mNGS的读长和测序深度难以分析亚型，因此不建议mNGS常规用于耐药基因检测。而tNGS检测的靶标相对确定，可将水解酶亚型特定区段作为富集靶标，且相比mNGS的耐药基因检测限更低。使用临床标本进行tNGS耐药基因检测能获得相对更可靠的耐药结果。
共识6：结核分枝杆菌培养和药敏试验时间长，建议tNGS用于呼吸道标本的结核分枝杆菌鉴定、耐药基因及其突变位点的检测。
共识7：临床怀疑特定耐药菌感染，并且耐药基因与耐药表型关联性强时，可考虑送检tNGS，作为常规方法的补充。重点关注碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药基因和病原体。
共识8：进行新型冠状病毒、流感病毒等病毒变异监测时，可考虑选择覆盖基因组全长的tNGS。
共识9：建议tNGS引物或探针设计遵循特异、保守、碱基均匀的原则，引物/探针及目的片段大小应控制在适当的范围，如扩增子长度宜在200 bp内，探针长度宜介于80~120 bp。引物和探针需完成干实验和湿实验的性能评价。
1.实验室防污染措施
共识10：tNGS实验过程中靶标被极大富集，核酸污染风险大，建议对实验室环境、试剂、实验操作、废弃物处理等制定严格的防污染制度和预案，并定期监测实验室核酸污染。
2.生物信息降噪措施
共识11：试剂工程菌、背景环境菌、环境中的气溶胶可能导致假阳性结果。建议通过生物信息分析建立试剂和环境的基线数据库，以提高检测准确性和可靠性。
共识12：tNGS检测中引物/探针、酶等关键原材料或检测流程中关键参数的调整可能影响检测性能。建议每次优化后的试剂和流程进行性能确认。
共识13：建议进行全流程质控，包含阴性对照、阳性对照、内参、数据量、数据质量等，且在临床报告中体现质控结果。
临床标本规范采集的要求与mNGS无差异，可参考已有专家共识和行业标准。
共识14：核酸提取试剂盒应兼顾不同病原类型的提取效率，试剂工程菌不应涵盖在靶标范围内。
共识15：根据不同症候群、靶标范围、扩增富集效率等因素确定文库长度和最低测序数据量；测序平台的选择还应考虑测序准确性、稳定性、测序时间和成本等因素。
共识16：为确保数据质量可满足后续分析要求，建议实验室对原始测序数据进行质控和过滤，建立生物信息学数据库和分析流程，并针对此部分进行性能确认与验证。
共识17：建议实验室在国际/国内公认的公共数据库的基础上筛选高质量序列，建立本地化比对参考数据库，可包括耐药基因和毒力基因。tNGS数据库还应关注引物扩增区域以及探针捕获区域的序列特征，用于病原分型及耐药基因突变位点检测。
共识18：实验室综合考虑标本类型、靶标类型、富集效率等因素，设立不同病原体的阳性判断值，并基于其他实验室检测结果、影像学和临床诊断等复合标准优化和确认该阳性判断值。
共识19：实验室应建立用于监测和管理生物信息学分析程序、流程及数据库的版本号，并记录版本日志，以保证报告的可复现性和可信度。
共识20：实验室应对生物信息分析的结果进行解释和验证，包括解释检出的微生物物种、基因以及突变位点的生物学和生物信息学的意义。
共识21：测序数据可考虑以fastq或bam格式双份存储于不同的储存介质，同时做好软件账户的访问权限控制。为保证数据安全，推荐部署本地服务器，并与外部网络物理隔离。
tNGS的报告发放和解读团队包括微生物实验室技师/医师和临床医师。相比mNGS，在报告发放和解读的过程中应额外考虑tNGS的病原覆盖范围是否已涵盖临床关注的病原体、预设病原靶标的覆盖度等。
报告发放与解读的关键步骤包括：基于质控信息判定结果可靠程度、病原微生物注解致病性分级、责任病原体临床判读、阴性结果临床判读、耐药基因信息判读、多学科会诊和总结（必要时）。
共识22：建议对报出的微生物致病性给出初步注解，分为致病性微生物、条件致病微生物或定植微生物。
共识23：建议结合标本类型、病原种类、均一化序列数等指标进行报告解读，在临床信息基础上判断该病原的致病等级。
共识24：阴性结果不建议单独作为排除依据，应结合tNGS的靶标覆盖范围、标本类型和其他临床辅助检查进行综合判断。
共识25：建议结合相对应的病原微生物均一化序列数、耐药机制、tNGS的探针/引物设计靶标范围综合解读耐药基因检测结果。
节选自《靶向高通量测序（tNGS）在感染性疾病中应用与实践专家共识》
查看更多
中国医学论坛报
壹生
今日肿瘤
今日循环
今日糖尿病
今日口腔
全科周刊
脱贫地区农副产品网络销售平台
京公网安备 11010202008182号
| 互联网新闻信息服务许可证编号：10120190017