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上节：
mNGS标本采集与保存
01
mNGS感染部位标本采集要求
血液：G管，成人3～5 ml，幼儿＞1.5 ml。采血后立即轻轻颠倒混匀8～10次，防止溶血。
脑脊液：无菌采样管，1.5～3 ml，建议第2管以后的脑脊液送检。
肺泡灌洗液：无菌采样瓶，＞5 ml，弃去前段可能污染部分，收集其余部分至少5 ml以上立即送检。
深部痰：无菌采样瓶，＞3 ml，用生理盐水漱口2～3次，用力咳出深部痰液或气管抽吸物。
组织及其他：无菌采样瓶，无菌体液＞3 ml，切取绿豆粒大小深度组织或2～3针穿刺组织；10～15片石蜡切片。
02
标本采集指导原则
抗菌药物使用前采集标本；
取感染病灶部位作为标本；
严格无菌操作；
准确填写相关信息。
03
标本运送指导原则
血液：全血样本室温（6～35℃）放置，2天内寄送。
非血液标本：采集后当天送检，4℃暂存；1周内送检，-20℃冷藏；长期保存，-80℃低温保存。建议所有标本均应尽快送往实验室检测。
04
感染病原检测的推荐标本类型
对于怀疑不同部位的感染，推荐样本和推荐流程不同，如下图所示。
05
检测结果结合临床，分析致病原因
由于mNGS的检测目标是核酸，所以对于一些破壁比较困难的病原体，如隐球菌、结核杆菌等，即使mNGS报告中显示的序列数较少，也应引起临床高度重视。在寻找病原时，去除低质量测序数据，再去除人源基因信息，留下的就是临床所需信息，即严格致病菌、人体中的条件致病菌、环境中的机会致病菌。如下图所示，中间留下的是明确的阳性菌，万万不能遗漏，例如结核分枝杆菌、烟曲霉、军团菌、诺卡菌、隐球菌等，需要给予临床干预；而重叠部分是机会致病菌，如链球菌、葡萄球菌、念珠菌、奈瑟菌、非结核分枝杆菌等，需要结合临床进行客观分析，然后判断是否需要干预。
mNGS报告解读
01
报告读取
在mNGS报告中出现的如序列数、相对丰度、鉴定置信度等名词，它们代表的意义不同。某微生物的检出序列数、检测深度、检测离散度和基因组覆盖度越高，表示检测到该微生物的可靠性越高，丰度越高表示其在相同类型微生物中所占比例越高。
检出序列数（reads）：是指匹配到该病原体的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。
基因组覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖该微生物整个基因序列的比值。
鉴定置信度：根据序列比对数、基因组大小和基因组保守性，判断样本中存在该微生物的可信度。
检测深度：是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数。
微生物丰度：是指该微生物在整个标本中检测到的相同类型微生物中所占的比重。
02
检测阳性=致病菌吗？
mNGS技术是基于病原体的核酸序列进行检测，客观反映标本中存在的微生物核酸及其组成，包括人体微生态菌群，检测阳性不一定是致病菌。过去临床对于病原检测阳性结果的判断来自于培养，但到目前为止，绝大部分的微生物是不可培养或者培养周期长，对于检测结果定义为“真阳性”还是“假阳性”需要重新认识，究竟是“真阳性”还是“假阳性”，还需要结合患者的临床症状、宿主的免疫反应进行综合评价。对于严格致病菌，如隐球菌、曲霉菌、结核杆菌、军团菌、鹦鹉热衣原体、诺卡菌、流感病毒、马尔尼菲篮状菌、脓肿分枝杆菌、荚膜组织胞浆菌等，需要予以高度重视。对于罕见及特殊病原体，应检索文献，结合具体情况，再具体分析。
03
定植？感染？
对于究竟是定植还是感染，mNGS结果目前无法准确区分。细菌进入机体能否引起感染取决于两方面因素，一是细菌的致病力，二是机体的防御能力。病原体检验阳性并非一定就是感染，或一定是该病原体感染。需依据感染部位、患者临床表现特点以及患者不同病理生理特点来分析。对于开放体系的样本，如肺泡灌洗液、痰液，mNGS具有广覆盖的特点，一次检测能够客观反映样本中含量在检测限以上的病原体及相对占比。暂时单一的病原宏基因组检测结果无法区分定植与感染。未来宏转录组学与人体免疫反应基因靶向捕获等方面的研究可能有助于解决这一难题。
04
阴性结果，样本就真的是阴性吗？
如果mNGS结果是阴性的，需要临床医生多维度解读这一结果。一方面，这可能是非感染性疾病，如恶性肿瘤、结缔组织病、炎性血管疾病等。另一方面，如果结合临床仍然不能排除感染性疾病，需要追溯原始数据是否被排除掉了。
对于mNGS测序报告的解读，需遵循的原则如下：①需要结合传统的检测手段综合分析判断；②要排除背景菌、污染菌及定植菌，再结合临床确定病原体；③对于厚壁菌和胞内菌，如隐球菌等，即使仅有1条序列数，也有临床意义；④有疑似病原体时，需要追溯到原始数据；⑤如果进行RNA检测，需提前告知。因RNA容易降解需要立刻低温保存；⑥临床治疗时，先经验性用药，再转为精准用药；⑦早期检测有利于指导用药；⑧用药指导要遵循当地流行病学特征，因为宏基因没有明确的用药指导，需要依据各地具体情况。
作者：董睿，高延秋
来源：重症肺言
下节：
mNGS的运用实例
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