系统性红斑狼疮患者外周血T细胞亚群的变化及意义

徐雪 裘昊雯 郑舒聪 薛愉 吕玲 邹和建

为了研究系统性红斑狼疮(systemiclupusery— thematosus，SLE)患者外周血辅助性 T(Th)细胞及细胞毒性 T(Tc)细胞表达细胞因子的水平，我们采用 四色流 式 细胞 术 检 测 SLE 患者 外 周 血 CD3 CD8一T细胞 (Th细胞 )和 CD3 CD8 T细胞 (Tc细胞)中 IFN一 和 IL一17的表达水平 ，探讨这些变化与疾病 的关 系 。

材料和方法

研究对象：入选病例为华山医院风湿科住院的 SLE患者 ，共 27例 ，诊断均符合 1997年美国风湿病协会修订的 SLE分类标准 ，其 中男性 3例 ，女性 24 例，年龄 19～72岁 ，平均(364-12)岁 ，病程 1个月 ～ 12年 ，平均 (38±25)个月。根据 SLEDAI评分将 患者分为活动组和非活动组 。正常对照组 22名 ，来 自我院门诊体检的健康志愿者。

细胞刺激培养 ：清晨空腹抽取 SLE患者和健康对照者外周血 4ml，置于肝素钠抗凝管中。Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核 细胞 (PBMC)，用 RPMI1640培养液稀 释 PBMC终浓度至 1×10。细胞／ml，取 PBMC稀释液加于 24孔板 中，每孔 1ml 细胞悬液。将每个样本 的细胞悬液分为空 白孔 、佛波酯 (PMA)／离子霉素(Ionomycin，Io)孔共 2孔 ，在不同的孔 中加入 相 应 的试 剂 ，PMA终 浓度 为 50 ng／ml，Io终浓度为 1000rig／ml，将细胞置于培养箱中孵育 6h，最后 5h每孔加入 10 g／mlBrefeldinA (BFA)。

流式细胞仪分析 ：标 本 中加 入 CD8．APC 和 CD3一PE—Cy5．5，避光孵育 30rain。洗涤后 ，每管加入固定液，避光孵育 15rain。洗涤后 ，每管加入破膜剂 ，避光孵育 10rain。每管加入相应荧光标记抗体 IL—l7一PE和 IFN-^y-FITC，避光孵育 30min。应用流式细胞仪 ，检测 T细胞亚群的分布。

统计学方法：应用 SPSS12．0软件包进行统计分析，对于正态分布的计量资料用 4- 表示，组间 比较采用 t检验。以 P<0．05为差异有统计学意义。

结果与讨论

IL一17已证实其参与多种 自身免疫性疾病 的发病 ，如系统性硬化 、类风湿关节炎 、银屑病等 ，但在人类狼疮体 内研究甚少 ，且研究结果不一。由于应用 PMA／Io刺激 T细胞后 ，会诱发细胞表面 CD4分子被内吞¨ ，故用 CD3和 CD8来界定 CIM T细胞 ，即 CD3 CD8一细胞。本 实验发现 PBMC在无PMA／Io 刺激 培 养 下 ，SLE 患 者 Thl7细 胞 (CD3 CD8一IL一 17 T细胞 )、Tcl7细胞 (CD3 CD8 IL．17 T细胞 ) 百分 比 与 对 照 组 相 比，差 异 无 统 计 学 意 义；经 PMA／Io体外培养 6h后 ，SLE患者外周循环中 Thl7 细胞 比例显著高于对照组 ，而 Tcl7细胞 比例在两组间无明显差异(表 1)。上述结果表明 SLE患者体内可能存在某些预刺激原 ，使 SLE患者 PBMC已处于预刺激状态 ，在体外 受到完全刺激 信号如 PMA／Io 介导的钙信号刺激后会 出现反应过度 ，异常激活并表达、分泌 IL一17增多。

本研究还发现 ，无论有 无刺激培养 ，SLE患者 Thl(CD3 CD8一IFN一^y )细胞 百分率 与对 照组相比，差异均无统计学 意义；而 SLE患者 Tcl(CD3 CD8 IFN-^y )细胞经 PMA／Io培养后 ，百分率 明显高于对照组(表 1)。结果提示 Thl细胞可能在 SLE 病程 中变化的程度较小 ，说明在 SLE发生和发展过程中，Th17细胞亚群 比例增加可能是 SLE发病过程中的一个重要因素 ，Thl7细胞可能通过其分泌的细胞因子作用于不 同靶细胞 ，诱导其他细胞 因子 的产生 ，从而导致 SLE患者机体免疫调节功能的紊乱 。 Wong等 最近研究发现 SLE患者血浆 IL一17及体外 PBMC经 IL一23诱 导产生 的 IL一17水平均较对照组明显升高 ，说 明 IL．23／IL．17炎症轴中 IL一17是促进 SLE 自身免疫 炎症反应 的有效刺激因子。另有研究表 明[31，Thl7细胞可促进 B淋巴细胞产生免疫 球蛋白，增强 B淋巴细胞的功能。而炎症反应和 B 淋巴细胞活性增强均可见于 SLE患者。因此 ，推测 Thl7细胞亦有可能通过此机制参 与了 SLE患者的发病。由于 SLE患者外周血 Th细胞 和 Tc细胞分泌 IL．17和 IFN一 的水平 随病情 、病程 、治疗措施 的不同而存在较大差异 ，故我们分别观察不 同临床实验室指标 的患者外周血细胞合成 IL一17和 IFN一 的水平。结果表明，SLE患者 PBMC中 Thl7细胞百分 比与 SLE疾病活 动指数 (SLEDAI)呈 正相关性 (r= 0．426，P=0．034)；而 SLE患者 Thl、Tcl、Tcl7细胞百分比与 SLEDAI均无直线相关性 。未发现各 T细胞亚群与抗 dsDNA抗体、血沉 、C反应蛋 白的相关性 。这些结果进一步证实 了 SLE患者 Thl7细胞与疾病活动度关系密切 ，提示其可能是反映 SLE患者的疾病活动性和病情严重度的有效指标之一。然而 ，CD4 产生 IL—l7的 T淋巴细胞并不能作为 Thl7的惟一识别标志。最新的研究表明，无论是体外还是体内研究 ，都发现一种既能产生 IFN一^y又能分泌 IL．17的 T淋 巴细胞 。本研究亦发现 SLE患者外 周 血 中 CD3 CD8一IL一17 IFN一 细 胞 比例 (0．51±0．38)％ 较 正 常 对 照 组 升 高 (0．29±0．18)％ (P=0．047)，而 CD3 CD8 IL一17 IFN一细胞 比例在两组 中差异无统计学意义。表明 CD4 双分泌细胞既是 IL一17的又一来 源，也可能在 SLE 免疫发病中起了一定作用 ，有待进一步研究。 SLE的发生和发展 ，是不同 T细胞亚群及其分泌的若干种细胞因子相互作用 的网络效应 ，共 同参与免疫病理过程。 目前越来越多的研 究提示 Thl7 细胞及其相关 细胞 因子在 SLE发病过程 中起着重要作用 ，可为 SLE治疗提供一个新 的参考资料。

参 考 文 献 

[1] KogaC，KabashimaK，ShiraishiN，eta1．Possiblepathogenic roleofThl7cellsforatopicdermatitis．JInvestDermatol，2008， 128(11)：2625-2630． 

[2] WongCK，LitLC，TamLS，eta1．HyperproductionofIL-23and IL 17 in patientswith systemiclupuserythematosus：implications fbr rh17．mediated inilammationin auto．immunity． Clinlmmuno1． 2008，127(3)：385-393． 

[3] AnnunziatoF，CosmiL，SantarlasciV，eta1．Phenotypicand functionalfeaturesofhumanThl7cells．JExpMed，2007，204 (8)：l849-1861．