郑静  浙大附属第一医院  撰稿

摘要

靶向测序作为一种精准的基因检测技术，在肿瘤领域的应用日益广泛。本文详细阐述了靶向测序的技术原理、方法分类，重点探讨其在肿瘤驱动基因突变检测、肿瘤分子分型、肿瘤微小残留病监测、肿瘤耐药机制研究及肿瘤早筛中的应用。同时分析了该技术在临床实践中的优势与挑战，并对未来发展方向进行展望，旨在为肿瘤精准诊疗提供全面的技术参考，推动肿瘤治疗水平的提升。

一、引言

肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，其发生发展是一个多基因、多步骤的复杂过程。传统的肿瘤诊断和治疗方法存在一定局限性，难以满足精准医疗的需求。随着基因测序技术的飞速发展，靶向测序应运而生，它能够聚焦于特定的基因区域，高效、准确地检测肿瘤相关基因突变，为肿瘤的精准诊断、个性化治疗及预后评估提供关键信息，在肿瘤研究与治疗领域展现出巨大的应用潜力。

二、靶向测序技术概述

2.1 技术原理

靶向测序的核心原理是先通过特定方法将基因组中感兴趣的目标区域富集出来，然后对这些富集区域进行高通量测序。常见的富集方法包括基于 PCR 扩增和基于杂交捕获。PCR 扩增是利用特异性引物对目标基因片段进行扩增，使目标区域的 DNA 量显著增加，便于后续测序；杂交捕获则是设计与目标区域互补的探针，通过碱基互补配对原则与基因组中的目标区域结合，再将结合有探针的目标区域捕获下来进行测序 。

2.2 方法分类

2.1.1 Sanger 测序

Sanger 测序是靶向测序的经典方法，被视为测序技术的金标准。它基于双脱氧核苷酸（ddNTP）终止 DNA 合成反应的原理，通过电泳分离不同长度的 DNA 片段，从而读取 DNA 序列。Sanger 测序具有极高的准确性，读长可达 1000bp 左右，非常适合对高度聚焦的基因集或区域进行精确测序，常用于单基因疾病的诊断以及肿瘤驱动基因突变的验证 。例如，在对一些已知的单基因突变导致的肿瘤，如 BRAF V600E 突变在黑色素瘤中的检测，Sanger 测序能够准确判断突变是否存在。

2.1.2 基于 PCR 扩增的高通量测序

随着技术的发展，基于 PCR 扩增结合高通量测序平台的方法逐渐兴起。以 Ion AmpliSeq™技术结合 Ion PGM™系统为例，该技术通过设计针对多个基因的特异性引物池，能够在一天内轻松靶向和测序数百个基因。这种方法快速、经济，适用于多基因 Panel 的检测，可同时检测多个肿瘤相关基因的突变情况，为肿瘤的分子分型和综合诊断提供丰富信息 。比如在肺癌的多基因检测中，可以同时检测 EGFR、ALK、ROS1 等多个驱动基因，有助于全面了解肿瘤的分子特征。

2.1.3 基于杂交捕获的高通量测序

对于更大规模、更高密度的靶标区域，如高达～60MB 的区域，Ion TargetSeq™富集系统等基于杂交捕获的高通量测序技术具有优势。该技术通过与目标区域互补的探针进行杂交捕获，能够更全面地覆盖目标基因区域，减少非特异性扩增，提高测序的准确性和深度。在肿瘤全外显子测序（WES）中，杂交捕获技术可以捕获外显子区域，对其中的基因变异进行全面检测，有助于发现潜在的肿瘤驱动基因 。

三、靶向测序在肿瘤研究与治疗中的应用

3.1 肿瘤驱动基因突变检测

肿瘤的发生发展往往与某些关键基因的突变密切相关，这些突变被称为驱动突变。靶向测序能够精准检测这些驱动基因突变，为肿瘤的诊断和治疗提供重要依据。例如，在非小细胞肺癌中，EGFR 基因突变是常见的驱动突变之一，约 10%-40% 的患者存在 EGFR 突变 。通过靶向测序准确检测 EGFR 突变类型，如常见的 19 号外显子缺失突变和 21 号外显子 L858R 点突变，对于指导患者是否适合使用 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗至关重要。携带这些敏感突变的患者使用 EGFR-TKI 治疗往往能取得显著疗效，肿瘤得到有效控制，患者生存期延长。同样，在结直肠癌中，KRAS 基因突变状态决定了患者是否适合使用抗 EGFR 单抗类药物。约 30%-40% 的结直肠癌患者存在 KRAS 基因突变，对于 KRAS 野生型的患者，使用西妥昔单抗等抗 EGFR 单抗药物可能有效，而 KRAS 突变型患者使用此类药物则疗效不佳 。因此，通过靶向测序明确 KRAS 基因突变状态，有助于筛选出可能从特定治疗中获益的患者，避免不必要的治疗和经济负担。

3.2 肿瘤分子分型

肿瘤具有高度的异质性，不同分子分型的肿瘤在生物学行为、治疗反应和预后等方面存在显著差异。靶向测序能够检测肿瘤细胞中多个基因的突变情况，根据这些基因突变特征对肿瘤进行精准分子分型。以乳腺癌为例，传统上根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体 2（HER2）的表达情况将乳腺癌分为 Luminal A 型、Luminal B 型、HER2 过表达型和三阴型。随着基因测序技术的发展，通过靶向测序发现乳腺癌还存在 PIK3CA、PTEN 等基因的突变，这些基因突变进一步细化了乳腺癌的分子分型 。对于 PIK3CA 突变的乳腺癌患者，可能对 PI3K 抑制剂治疗更为敏感；而 PTEN 缺失的患者，可能需要调整治疗策略以应对其特殊的生物学行为。在淋巴瘤中，靶向测序也有助于区分不同的分子亚型。例如，弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）根据基因表达谱和基因突变情况可分为生发中心 B 细胞样（GCB）型和活化 B 细胞样（ABC）型 。GCB 型 DLBCL 患者预后相对较好，而 ABC 型患者预后较差，且对治疗的反应也有所不同。通过靶向测序明确 DLBCL 的分子亚型，能够为患者制定更具针对性的治疗方案，提高治疗效果。

3.3 肿瘤微小残留病监测

肿瘤微小残留病（MRD）是指肿瘤患者经过治疗后，体内残留的少量肿瘤细胞，是肿瘤复发的重要根源。传统检测方法如影像学检查和肿瘤标志物检测在 MRD 检测方面存在灵敏度不足的问题。靶向测序能够检测到极低水平的肿瘤细胞相关基因突变，为 MRD 监测提供了一种高灵敏度的手段。在白血病治疗中，通过对患者治疗后的骨髓或外周血样本进行靶向测序，检测白血病相关基因突变的残留情况，能够及时发现 MRD 。例如，在慢性髓系白血病（CML）患者接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗后，通过检测 BCR-ABL 融合基因的残留水平，可以评估治疗效果和预测疾病复发风险。如果在治疗过程中检测到 BCR-ABL 融合基因水平持续升高，提示可能存在 MRD，需要及时调整治疗方案。在实体瘤中，如结直肠癌患者术后，通过对血浆中循环肿瘤 DNA（ctDNA）进行靶向测序，检测肿瘤相关基因突变，能够监测 MRD 。研究表明，术后血浆中 ctDNA 阳性的结直肠癌患者复发风险明显高于 ctDNA 阴性患者，通过早期监测 MRD，可提前采取干预措施，如辅助化疗或其他治疗手段，降低肿瘤复发率，提高患者生存率。

3.4 肿瘤耐药机制研究

肿瘤细胞对治疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的主要原因之一。靶向测序有助于深入研究肿瘤耐药机制，为克服耐药提供策略。以肺癌 EGFR-TKI 耐药为例，部分患者在使用 EGFR-TKI 治疗一段时间后会出现耐药现象。通过对耐药患者肿瘤组织或 ctDNA 进行靶向测序，发现多种耐药机制 。其中，最常见的是 EGFR T790M 突变，约 50%-60% 的 EGFR-TKI 耐药患者会出现该突变 。此外，还存在 MET 基因扩增、HER2 基因扩增、BRAF 基因突变等旁路激活机制导致的耐药。通过靶向测序明确耐药机制后，可以针对性地开发新的治疗药物或联合治疗方案。针对 EGFR T790M 突变，已经研发出第三代 EGFR-TKI 奥希替尼，能够有效克服 T790M 突变导致的耐药 。在乳腺癌中，曲妥珠单抗是治疗 HER2 阳性乳腺癌的重要靶向药物，但部分患者会出现耐药。研究发现，PIK3CA 基因突变、HER2 基因扩增以外的其他 HER 家族成员激活等机制与曲妥珠单抗耐药相关 。通过靶向测序检测这些耐药相关基因突变，有助于为曲妥珠单抗耐药患者制定新的治疗策略，如联合使用 PI3K 抑制剂等。

3.5 肿瘤早筛

肿瘤早期诊断对于提高患者生存率和改善预后具有重要意义。传统的肿瘤筛查方法如影像学检查和肿瘤标志物检测在肿瘤早期往往灵敏度较低。靶向测序通过检测肿瘤相关基因突变，有望实现肿瘤的早期筛查。例如，在肝癌早筛中，研究发现血浆中游离 DNA（cfDNA）的甲基化模式和基因突变与肝癌的发生密切相关 。通过对 cfDNA 进行靶向测序，检测特定基因的甲基化状态和突变情况，可以在肝癌早期阶段发现病变，提高肝癌的早期诊断率。在结直肠癌早筛中，粪便 DNA 检测结合靶向测序技术逐渐成为研究热点。粪便中含有肠道脱落细胞释放的 DNA，通过对粪便 DNA 中结直肠癌相关基因突变如 KRAS、APC 等进行靶向测序，能够在无症状人群中筛查出早期结直肠癌患者 。研究表明，这种基于粪便 DNA 靶向测序的早筛方法具有较高的灵敏度和特异性，有望成为大规模结直肠癌筛查的有效手段。

四、靶向测序在临床实践中的优势与挑战

4.1 优势

4.1.1 高灵敏度与特异性

靶向测序能够聚焦于特定基因区域，对目标基因突变进行高深度测序，因此具有极高的灵敏度，能够检测到低频率的基因突变。在肿瘤 MRD 监测中，能够检测到每百万个正常细胞中存在的 1 个肿瘤细胞相关基因突变 。同时，由于其靶向性，减少了对无关区域的测序，降低了背景噪音，提高了检测的特异性，准确识别真正的肿瘤相关基因突变，避免误诊。

4.1.2 快速高效

相较于全基因组测序等技术，靶向测序只需对特定基因区域进行富集和测序，大大缩短了测序时间和数据分析时间。基于 PCR 扩增的靶向测序方法如 Ion AmpliSeq™技术结合 Ion PGM™系统，能够在一天内完成多个基因的测序工作 ，满足临床快速诊断的需求，使患者能够及时得到准确的诊断结果并接受相应治疗。

4.1.3 经济实惠

全基因组测序成本较高，而靶向测序仅针对特定基因区域，所需测序数据量小，实验成本和数据分析成本都显著降低。在多基因 Panel 检测中，一次检测多个基因的成本相对较低，对于临床大规模应用具有重要意义，能够在保证检测效果的同时，减轻患者和医疗系统的经济负担 。

4.2 挑战

4.2.1 技术局限性

尽管靶向测序技术不断发展，但仍存在一些技术局限性。例如，对于一些高度复杂的基因区域，如具有高度重复序列或结构变异的区域，靶向测序可能难以准确覆盖和检测，容易出现漏检或误判 。在检测某些基因融合时，由于融合位点的多样性和复杂性，传统的靶向测序方法可能无法全面准确地检测到所有融合类型，影响对肿瘤分子特征的准确判断。

4.2.2 数据分析复杂

靶向测序产生的数据量虽然相对全基因组测序较小，但数据分析过程仍然复杂。需要专业的生物信息学知识和工具对测序数据进行比对、变异检测、注释等分析 。不同的分析软件和参数设置可能会导致结果的差异，而且对于检测到的基因突变，需要准确解读其临床意义，这对临床医生和生物信息学人员都提出了较高要求。例如，某些基因突变的致病性尚不明确，需要结合大量的文献资料和临床研究进行综合判断，增加了数据分析的难度和不确定性。

4.2.3 临床应用标准化不足

目前靶向测序在临床应用中缺乏统一的标准化流程，包括样本采集、处理、测序方法选择、数据分析以及结果解读等方面 。不同实验室之间的检测结果可能存在差异，影响了靶向测序在临床实践中的推广和应用。例如，在肿瘤组织样本采集过程中，样本的质量和代表性可能因采集方法和部位的不同而有所差异；在测序方法选择上，不同实验室可能根据自身条件和经验采用不同的技术平台和富集方法，导致检测结果的可比性降低。

五、未来发展方向

5.1 技术创新与优化

未来靶向测序技术将不断创新和优化，以克服现有的技术局限性。研发更高效、准确的富集技术，提高对复杂基因区域的覆盖度和检测准确性。开发新的测序化学方法和仪器设备，进一步提高测序深度和灵敏度，降低测序误差 。例如，基于纳米孔技术的靶向测序有望实现单分子水平的测序，提高对低频率突变和结构变异的检测能力；结合人工智能和机器学习技术，优化数据分析流程，提高数据分析的准确性和效率，能够自动识别和解读复杂的基因突变信息。

5.2 多组学联合应用

随着肿瘤研究的深入，单一的靶向测序技术难以全面揭示肿瘤的生物学特性。未来将加强多组学联合应用，将靶向测序与转录组学、蛋白质组学、代谢组学等技术相结合 。通过整合不同组学的数据，能够从多个层面深入了解肿瘤的发生发展机制、分子分型、耐药机制等，为肿瘤的精准治疗提供更全面、准确的信息。在肿瘤诊断中，结合基因组测序和蛋白质组学分析，不仅可以检测基因突变，还能了解基因表达产物蛋白质的变化情况，提高诊断的准确性和可靠性。在治疗方案制定方面，多组学联合分析能够为患者提供更个性化的治疗策略，提高治疗效果。

5.3 临床应用标准化与普及

推动靶向测序临床应用的标准化建设，制定统一的样本采集、处理、测序方法、数据分析和结果解读的标准流程，提高不同实验室之间检测结果的可比性和一致性 。加强对临床医生和相关技术人员的培训，提高其对靶向测序技术的理解和应用能力，促进靶向测序技术在临床实践中的广泛普及。建立临床应用质量控制体系，定期对实验室的检测结果进行评估和验证，确保检测质量。通过标准化和普及化，使更多的肿瘤患者能够受益于靶向测序技术带来的精准诊疗服务。

六、结论

靶向测序作为肿瘤精准诊疗的关键技术，在肿瘤驱动基因突变检测、分子分型、MRD 监测、耐药机制研究和早筛等方面发挥着重要作用。其具有高灵敏度、特异性、快速高效和经济实惠等优势，但也面临技术局限性、数据分析复杂和临床应用标准化不足等挑战。未来，随着技术的不断创新优化、多组学联合应用的发展以及临床应用标准化与普及，靶向测序将在肿瘤研究与治疗领域发挥更大的作用，为肿瘤患者带来更多的生存希望，推动肿瘤精准医疗进入新的发展阶段。

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