肝豆状核变性又称Wilson病(WD)，是一种常染色体隐性遗传病，由位于13号染色体上的ATP7B基因突变引起铜(Cu)排泄减少。过量的Cu会导致多种临床表现，包括神经系统症状、急性或慢性肝衰竭和/或精神症状。1932年，Cheng[1]首次报道了中国的两例WD病例，WD的流行程度因地理区域而异，亚洲国家的发病率比西方国家高[2]。WD的常规诊断是根据其临床症状和血铜蓝蛋白(CP)、24 h尿Cu、角膜K-F环等生化指标作为筛查指标，Leipzig评分可以提高诊断效能。但在大多数受影响的患者中，WD表现为肝功能障碍或不明原因的CP水平降低，加之WD的临床表现多样化，早期诊断困难。此时，应行肝组织病理学检查和ATP7B基因检测联合分析[3]。而基因诊断有着重要的临床意义，并在我国逐渐成为一种常规检测[4]。经过规范化治疗，患者预后良好，与普通人无差异。因此，WD的早期诊断和规范治疗至关重要，以防止疾病恶化[5]。目前绝大多数患者需要终生服药来控制Cu在其体内的吸收和储存。

1.发病机制

1.1 人体内的Cu稳态

人们每天从饮食中摄入1.5~5 mg的Cu，其中50%~ 60%未吸收的Cu随粪便排出; 25%~40%从十二指肠吸收，由肠细胞储存。在肠道池中，Cu与循环中的白蛋白结合，75%运输到肝脏进行调节和排泄，剩下的25%进入血液循环。在肝脏中，20%(2.5 mg/d)的Cu通过胆汁排泄且其中很大一部分(约80%)再次被肠黏膜重新吸收，少量(20%)随粪便排出。80%的Cu被转运到外周，与CP结合。因此，Cu每天的粪便排泄是未吸收的摄入Cu和少量排出的内源性Cu的组合，为1.5~4 mg/d。

Cu是许多酶的辅助因子，是正常新陈代谢所必需的。如参与呼吸作用[如细胞色素C氧化酶(COX)]、神经内分泌肽(如肽基-α-单加氧酶)的激活、色素沉淀(如酪氨酸酶)、儿茶酚胺的合成与清除(如多巴胺-β-单加氧酶)、自由基防御[如超氧化物歧化酶(SOD)1和SOD3]以及许多其他的细胞反应过程[6]。Cu的摄取是通过铜转运蛋白1(CRT1)发生在肝细胞基底外侧。Cu伴侣将Cu运送到特定的细胞内靶点，例如：SOD的Cu伴侣将Cu运送到SOD; 线粒体中的一组伴侣蛋白(Cos11、Cos17、SCO1和SCO2)，将Cu传递给COX; 在反式高尔基网络(TGN)中，Cu转运蛋白(ATOX1)将Cu转运至Cu转运ATP酶1(ATP7A) 和跨膜Cu转运ATP酶2 (ATP7B)。ATP7B有助于将Cu转运到TGN和Cu的胆道排泄。在肝细胞内，ATP7B在TGN或细胞质囊泡中发挥两种重要功能。在TGN中，ATP7B通过将6个Cu分子运输到原血浆CP中，激活功能性CP。在细胞质中，当细胞内Cu离子水平升高时，ATP7B将多余的Cu释放到囊泡中，并通过胞外排出，穿过根尖管膜进入胆汁。在这一过程中，ATP7B借助ATP水解释放的能量磷酸化，随后脱磷酸化释放Cu跨膜所需的能量[7]。因此，ATP7B依赖性胆汁Cu排泄是维持Cu代谢平衡的主要方式。

1.2   Cu毒性相关机制

WD是由编码P型ATP酶的ATP7B基因缺陷引起的。该蛋白的作用是将Cu装载到高尔基体中原血浆CP上，在肝细胞中成为功能性CP。CP经胆道排泄，作为清除体内多余Cu的主要途径。在WD中，ATP7B蛋白的功能障碍导致无法将Cu装载到高尔基体中的原血浆CP上，从而不能适当地将Cu排泄到胆汁中。结果，Cu在肝细胞中积聚，随后释放到血液中。血液中存在两种Cu池: 与CP结合(85%~95%)和非CP结合或游离铜(5%~15%)，后者与白蛋白松散结合，可被细胞摄取或参与代谢[8]。原血浆CP不与Cu结合，在血流中迅速降解，导致WD血清CP水平低。正常情况下，由于大多数血清Cu与CP结合，而在WD中CP水平较低，因此该病血清总Cu水平较低，游离Cu水平升高。

Cu的细胞毒性主要与其氧化还原特性有关。未结合的“游离”Cu离子与活性氧将通过芬顿样(Fenton-like) 反应导致对蛋白质、核酸和脂质高度有害的羟基自由基的出现。在亚细胞水平上，线粒体是Cu诱导毒性最敏感的靶点，线粒体利用细胞内的Cu进行呼吸，是细胞内Cu平衡的关键调节器。在细胞中，Cu与蛋白质或小分子配体严格结合并作为线粒体COX或SOD1的辅助因子，COX或SOD1分别处理Cu介导下的氧化还原或歧化反应[9]。故当体内Cu离子超负荷时，Cu的氧化还原活性不受控制，导致线粒体膜的结构、物理和生化完整性遭到破坏。然而对于WD，找到是否存在特定的线粒体Cu排泄途径来平衡线粒体Cu超载，在未来治疗中是非常可期的。有研究[10-11]认为，游离Cu的毒性作用也与Cu诱导的凋亡抑制剂功能障碍和caspase-3失控有关。

1.3   ATP7B分子结构和功能

ATP7B蛋白属P型ATP酶超家族，由位于第13号染色体长臂(13q14.3~q21.1)，全长约85 kb的ATP7B基因编码。P型ATP酶超家族有11类。IB类P型ATP酶负责运输Cu2+和其他重金属离子穿过生物膜[12]。ATP7B有8个跨膜螺旋。它的总体结构包括：一个大的N端结构域，其包含6个子结构域，每个子结构域都有一个金属结合位点(MBD)；ATP结合结构域由核苷酸结合域和磷酸化域组成；一个执行器结构域(A-结构域)；一个长长的C端尾。ATP7B与Cu在N端结构域结合，MBD在从Cu伴侣ATOX1接受Cu的过程中发挥核心作用。研究表明MBD对ATP7B活性的影响不等，MBD5和MBD6对ATP7B的催化活化作用强于MBD1~4[13]，并以ATP作为能量源，将其跨细胞膜运输。

综上可知，ATP7B维持细胞内Cu稳态，一旦其功能和结构受损，CP水平降低，肝脏出现Cu超载及发挥其Cu毒性，导致WD的各种临床表现。

2.ATP7B基因突变类型与临床表型关系

WD具有复杂的临床表型，现已有超过900多个ATP7B基因突变被发现。其中380个已经证实与疾病的发病机制有关[14]。大多数是错义突变，这些突变对ATP7B蛋白结构(例如，ATP7B完整性的丧失、错误折叠、蛋白间相互作用受损)和功能(磷酸化、Cu离子运输异常、ATP结合亲和力下降和细胞内运输异常)产生了不同程度的影响[15]。

在欧洲和亚洲人群中，最常见的突变分别是p.His1069Gln和p.Arg778Leu，其中复合杂合子比纯合子更为常见。在Das等[16]对纯合条件下p.His1069Gln和p.Arg778Leu进行的一项基因型-表型Meta分析中显示，p.Arg778Leu患者的发病年龄早，大多表现为肝脏症状和高尿Cu。p.His1069Gln患者主要表现为迟发性神经系统症状(平均发病年龄计算为20岁)。在张天鹤等[17]纳入的70例儿童肝豆状核变性的临床特点及基因分析的一项研究中显示，p.Arg778Leu突变的患者，血清CP水平较其他突变更低，多数表现为肝脏症状，差异具有统计学意义(P＜0.05)。一项纳入了55例WD患者的研究[18]中显示p.Arg778Leu突变可能在更早的年龄导致更严重的肝损害；一项对一个大型黎巴嫩近亲家庭76例成员的研究[19]表明，c.2299insC与肝脏疾病之间存在关联，p.Ala1003Thr突变与神经疾病之间存在关联。

而Zhang等[20]发表的一项共纳入1 366例中国WD患者的评估基因型-表型相关性的研究鉴定出了294例潜在致病性ATP7B变异，包括116例新变异，其中48个可归为“致病变异。变异频率依次为c.2333G＞T (p.Arg778Leu)、c.2975C＞T (p.Pro992Leu)、c.2621C＞T (p.Ala874Val)，并发现这些变异与肝脏或神经表现无关，而p.Ala874Val是构音障碍相关的独立因素。此外，这项研究强调了WD患者在发病年龄和ATP7B变异方面的差异，早发型患者以PTV(蛋白质截断变异)、p.Arg778Leu、p.Pro992Leu为主，晚发型患者以p.Ala874Val为主，且p.Arg778Leu/p.Ala874Val基因型患者的发病年龄高于p.Arg778Leu/p.Arg778Leu或p.Arg778Leu/p.Pro992Leu基因型患者。在一项来自印度不同地方的针对58例WD患者进行的研究[21]显示，最常见的变异为c.813C＞A (p.Cys271Ter) 并无法表明基因变异-临床表型的关系，认为额外的因素或基因可能在WD的病因中起作用。最近，刘攀等[22]对75例WD患儿进行了回顾性分析，结果显示该研究中最常见的突变类型为p.Arg778Leu、p.Ala874Val、p.Pro992Leu，并鉴定出了6个未报道的ATP7B新变异，且发现基因型-表型无明显相关性(表 1)。

表  1  ATP7B基因突变类型与临床表型关系

Table  1.  Relationship between ATP7B gene mutation type and clinical phenotype

总体而言，试图进行基因型-表型相关性研究的结果尚未得出明确的结论，主要原因是WD患者的表型特征较差，诊断较晚。遗传和环境因素也可能相互作用影响复杂的疾病表型; 然而，还需要进一步的大型研究来提供具体关联的结论性证据[6]并需与其他Cu代谢指标异常的遗传性疾病正确鉴别，具体见表 2。除了ATP7B异常突变外，Cu代谢结构域蛋白1、ATOX1、四氢叶酸亚甲基还原酶、凋亡抑制基因蛋白、人含Patatin样磷脂酶域蛋白3、二价金属转运蛋白1等异常亦可与改变WD的表型有关，但仍需进一步证明诊断或预测价值[2]。

表  2  WD与其他Cu代谢指标异常遗传性疾病的鉴别

Table  2.  Differential diagnosis of WD and other genetic diseases with abnormal copper metabolism indexes

3. 药物治疗进展

治疗的总目标是通过平衡Cu的摄入和排出来建立正常的Cu稳态。总结治疗方法：第一，如果早期诊断(在严重的肝脏或神经损伤之前)，并且终生坚持治疗，WD可以成功地通过药物来控制病情进展; 第二，应根据可能发生的不良事件进行药物的选择; 第三，对于正在接受药物治疗的WD患者，每年至少应进行两次监测，以确定治疗在临床改善和生化变化方面的有效性，从而评估治疗依从性并发现任何治疗诱导的不良事件(包括血清Cu、24 h尿Cu、血清CP、肝功能、神经和精神状态以及疾病对其他器官的任何影响); 第四，如果需要，对肝脏、神经或精神症状进行对症治疗，并随着时间的推移进行重新评估[6]。目前的治疗方法包括药物治疗、肝脏移植、基因治疗及细胞疗法。下面对药物治疗方面的进展进行综述。

目前治疗WD的药物包括传统螯合剂(青霉胺、曲恩汀、二羟丙磺酸钠及二羟丁二酸)，增加尿Cu排泄；锌盐及新型螯合剂(四硫代钼酸铵、双胆碱四硫钼酸盐)，减少Cu的消化道吸收。目前指南建议使用螯合剂(青霉胺和曲恩汀)作为有症状WD患者的首选治疗[14]。青霉胺是国内治疗WD患者的一线药物。由于其成本低，购买渠道方便，仍然是最常用的驱Cu剂。青霉胺在肝功能障碍患者中，通常在治疗的前2~6个月内出现临床改善，可在治疗开始1年后实现完全缓解。在神经障碍患者中，WD症状和体征消失较慢，缓解可能需要长达3年。儿童使用青霉胺的剂量是20 mg·kg-1·d-1，最大剂量为750 ~ 1 000 mg/d。成人初始剂量为125 ~ 250 mg/d，每4~7 d增加250 mg/d，维持剂量为750~1 500 mg，分2~3次剂量。食物会减少50%的吸收，所以在用药前1 h和用药后2 h都不能给食物。青霉胺作为吡哆辛拮抗剂可增加尿液中的维生素排泄。因此，建议每天补充25~50 mg维生素B6，以预防因吡哆辛缺乏而可能发生的贫血和/或周围神经炎症[25]。青霉胺有诸多不良反应：包括发烧、皮疹、骨髓抑制、淋巴结病、蛋白尿、肾毒性、肾病综合征、视神经炎、视网膜炎、红斑狼疮、重症肌无力、多发性肌炎等[26], Emre Parlar等[27]报道了1例使用青霉胺治疗WD并在治疗过程中出现弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)的患者，需要注意的是，在WD患者出现出血性并发症的情况下，在排除其他常见原因后，青霉胺可以引起血小板损伤，通过激活血管内凝血导致内皮损伤和DIC。此外，最令人担忧的情况之一是在治疗开始时出现严重和不可逆的神经系统恶化，它是由于在螯合剂治疗后Cu从肝脏释放而引起氧化性脑损伤。这可能发生在10%~50%既往有神经系统症状的患者[28]。在这些情况下，应该停用青霉胺，用其他药物替代。

曲恩汀(三乙烯四胺)是WD的替代螯合剂。它是精胺和腐胺的衍生物，以1∶ 1的比例与Cu结合形成稳定的络合物[29]。具有与青霉胺相似的作用机制和治疗效果。该药不稳定，需在2~8 ℃条件下保存，价格昂贵，目前国内尚未生产。曲恩汀的两种配方二盐酸曲恩汀和四盐酸曲恩汀，已经在部分欧美国家被批准使用，这两种产品都可以在室温下储存。曲恩汀治疗剂量为1 g/d, 分2~4次, 维持剂量为0.75~1 g/d。儿童用量按20 mg·kg-1·d-1计算。服药次数越多，依从性越差。Ala等[30]的一项前瞻性研究，共纳入了8例年龄在22~71岁的WD患者，所有患者接受每日单剂量曲恩汀(15 mg/kg)，并持续监测至第12个月。结果显示，所有患者临床症状均良好，没有发现新的神经体征，没有停止治疗或退出研究的情况。故认为，应进一步研究每日一次的曲恩汀作为WD的维持治疗。曲恩汀的潜在副作用包括全血细胞减少、出血性胃炎、味觉丧失、系统性红斑狼疮和神经系统恶化[25]。曲恩汀也可能导致神经性WD的恶化，因此，应该从低剂量开始，并像青霉胺一样缓慢增加。曲恩汀不能和铁一起服用，因为它会形成有毒复合物。口服青霉胺的驱Cu效果远高于曲恩汀, 一项对接受曲恩汀和青霉胺的患者的大型回顾性研究[31]表明，这两种药物的疗效相似，但青霉胺组的副作用较大。Weiss等[32]的研究表明，对青霉胺停药后的WD患者，盐酸曲恩汀是耐受性良好的治疗方法。曲恩汀是一种有效的替代Cu螯合剂，与青霉胺治疗相比，曲恩汀的不良反应相对较少, 因而被推荐用于治疗对青霉胺不耐受的WD患者[33]。

二巯基丙磺酸钠(DMPS)及二羟基丁二酸是在我国开创性用于治疗WD的广谱金属螯合剂。其作用机制为分子中的2个羟基与Cu离子结合，形成毒性较低的硫醇化合物后经肾小球滤过，最终通过尿液排出体内。前者驱Cu作用高于青霉胺，主要适用于对青霉胺过敏或出现严重的锥体外系症状的患者。最新指南建议DMPS成人剂量为500~750 mg，可分次静脉推注(3次/d)或滴注(1次/d)，5 d为1个疗程，儿童剂量为10~20 mg·kg-1·d-1。后者驱Cu作用较青霉胺弱，主要适用于轻-中度肝脏损害、神经精神症状及对青霉胺不耐受的WD患者，成人推荐剂量为750~1 000 mg/d，2次/d；儿童推荐剂量为10~20 mg·kg-1·d-1，2次/d。两种药物均可与锌剂联合使用，也可与青霉胺、锌剂交替使用。主要不良反应包括胃肠道反应、皮疹、发热、瘙痒等过敏性症状。需注意的是，由于DMPS不能通过血脑屏障，可能导致少数WD患者神经表现恶化[34]。

锌试剂对WD的治疗有明确的疗效，副作用较少，最常见的副作用是刺激胃肠道。锌的作用机制包括刺激肠黏膜上皮内金属硫氨酸的合成(一种内源性蛋白质金属螯合剂)。这种蛋白质优先结合肠细胞中的Cu，并抑制其渗透到门静脉循环。另一种作用是诱导肝脏金属硫蛋白结合Cu，防止其毒性损伤肝细胞。不同于青霉胺和曲恩汀，锌的作用是通过增加粪Cu的排泄。它的主要缺点是通常需要4~6个月才能发挥作用。因此，对于病情严重的WD患者，它并不是首选，主要是作为维持治疗。但对于症状前患者、孕妇和肝移植术后患者，一直作为一线治疗。锌盐成人治疗剂量为50 mg/d，3次/d；5岁以下儿童治疗剂量为25 mg/d，2次/d；5~15岁儿童治疗剂量为25 mg/d，3次/d。餐前或餐后1 h空腹服用。Avan等[35]认为，由于锌毒性水平很低，不良反应小，可被推荐作为神经系统症状的一线治疗方法。醋酸锌是唯一被美国食品药品监督管理局和欧洲药品质量管理局批准用于治疗WD的锌盐。由于副作用和价格较高，部分患者更倾向于使用葡萄糖酸锌或硫酸锌[14]。Munk等[36]的一项关于口服锌方案对人肝脏Cu含量影响的研究中认为，WD标准治疗醋酸锌方案(50 mg×3)与葡萄糖酸锌方案(50 mg×3)对肝脏Cu含量的降低程度相似。

目前尚不清楚锌和螯合剂联合治疗是否比单一治疗更有效，在Chen等[37]对涉及1 056例患者接受螯合剂与锌联合治疗WD的一项Meta分析中指出，与肝脏症状为主的患者相比，神经系统表现的患者更有可能从联合治疗中获益。因此，对于接受联合治疗的WD患者，临床医生应密切监测生化指标结果和临床疗程，特别是对肝脏表现的反应。

四硫钼酸盐是一种强力的除Cu剂，Ⅲ期临床试验结果[38]证实，四硫钼酸盐本身不会使神经功能恶化，因此特别适用于神经受累的WD患者。但四硫钼酸钠在伴有肝病的WD患者中的应用还存在一定的局限性，加上药物本身的不稳定性，并且伴有骨髓抑制、贫血和转氨酶升高等相关副作用，目前未被批准上市。双胆碱四硫钼酸铵(TTM)是一种新型药物, 其作用机制包括形成更稳定的Cu-TTM-白蛋白复合物，抑制肝脏和神经元Cu的摄取及促进Cu胆汁排出。此外，双胆碱TTM可以通过血脑屏障并进一步进入神经元细胞。由于传统螯合剂不能通过血脑屏障，因此，双胆碱TTM可能成为一种新的治疗策略，尤其对神经症状为主的WD患者有用[39]。双胆碱四硫钼酸铵临床Ⅲ期试验目前正在国外进行其长期疗效和安全性的评估。

甲烷氧化菌素是一种新型治疗WD的方法，目前正在进行研究，并在大鼠模型中取得了积极的结果。它可以从线粒体中去除Cu，避免细胞毒性和急性肝衰竭[40]。

4.总结与展望

WD患者的主要表现为肝脏、神经系统或精神症状。通常，神经系统症状出现较晚。肝脏症状主要出现在生命的早期，并可发展为严重的黄疸和肝硬化。ATP7B是目前已知的导致WD的唯一基因，基因型-表型的相关性已经被广泛研究，但直接原因仍未明确。未来需要更多精确、高质量、大规模的临床验证研究。进一步了解WD的发病机制，有助于明确WD患者的早期诊断和制定相应的个体化治疗方案，改善预后并避免误诊。

药物治疗仍然是控制WD的首要措施，但由于多数药物存在较大的副作用，因此，今后需要投入更多的前瞻性临床研究来寻找低毒性、高驱Cu作用的药物。此外，对症治疗和康复培训也是必不可少的。症状的明显改善提高了生活质量，增加了患者对治疗的信心和依从性。鼓励和帮助患者以乐观的态度参加适度的活动，恢复社会功能。目前基于基因检测的新兴医学治疗包括干细胞移植和基因疗法的发展对今后WD的治疗很有希望。