非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进行形式，其典型的病理特征在于肝脏的脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和不同程度的纤维化改变。流行病学调查显示，截至2019年NASH影响了全球人口的3%~5%[1]，与心血管和肝脏相关病死率的上升密切相关[2]。尽管，NASH的研究已有30多年的历史，但其发病机制目前仍未完全阐明。最新研究[3]表明，NASH是许多因素平行作用的结果，其中包括遗传易感性、脂毒性、氧化应激(oxidative stress，OS)、线粒体功能障碍、细胞因子和脂肪因子的改变，以及内质网(endoplasmic reticulum, ER)应激等方面。脂毒性是指毒性脂质在体内的超负荷堆积而引起细胞应激并诱导特异性信号传递，从而触发炎症和细胞死亡的一系列生物学过程。越来越多研究表明，脂毒性是促进NAFLD进展为NASH的重要机制。因此，本研究将重点阐述脂毒性对NASH的影响，探究其对炎症和肝细胞凋亡的具体作用机制，为临床NASH防治提供新思路。

脂毒性是Unger于20多年前创造的一个术语，用于描述过量游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)对胰腺β细胞存活的毒性作用。虽然该术语从未被正式定义，但已广泛用于描述由FFA及其代谢物所引起的细胞损伤和死亡的生物过程中[4]。肝脏作为脂质合成、代谢和储存的主要器官，在调节能量代谢方面具有重要作用[5]。研究[6]表明，在NASH的发病机制中，肝脏中占比最多的甘油三酯是一种安全的储存脂质，几乎没有毒性潜力。而相对少量的脂类物质，如游离胆固醇(free cholesterol, FC)[7]和FFA及其衍生物神经酰胺[8]等，可能对NASH的发展产生不成比例的巨大负面影响，是动脉粥样硬化和NAFLD等代谢相关疾病的主要危险因素[9]。这些物质不仅可以作用于一种或多种肝脏非实质细胞(non-parenchymal cell，NPC)，导致其活化，包括Kupffer细胞，肝星状细胞(HSC)和肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)等[7]。同时，还会影响多个细胞器的正常生理功能，如线粒体、内质网等，诱导细胞损害或死亡[8]。

1.1   游离胆固醇

胆固醇作为体内最丰富的固醇类化合物，不仅是构成细胞生物膜的主要组分之一，还是各种类固醇激素、胆汁酸和维生素D的前体。因此，胆固醇稳态对于维持机体正常的生理机能至关重要。有研究[10]表明，饮食、遗传和继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症会引起机体胆固醇信号异常，导致肝细胞内FC的异常积累。同时，肝细胞中略微增加的FC都会对多个细胞器和细胞过程产生高毒性。同样，在NASH的背景下，由超负荷的FC介导的脂毒性与肝损伤、炎症和纤维化的病理变化密切相关[11]。

1.2   游离脂肪酸

脂肪酸作为体内参与许多生物过程的必需脂质，不仅是机体的能量来源，还参与了生物膜的合成和能量储备。其中，脂肪酸摄取和代谢之间的不平衡是肝脏脂质堆积的主要原因之一。研究[12]表明, 脂肪酸作用的分子机制因化学分类而异，如饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸。大多数脂质的毒性作用是由饱和脂肪酸(如棕榈酸，也称为棕榈酸酯)提供的，而不饱和脂肪酸可一定程度上缓解细胞的毒性作用。其中FFA是被怀疑具有脂毒性的最常见成分之一。在NASH的进展过程中，脂肪组织中的胰岛素抵抗会导致脂肪分解增加，大量FFA释放入血。当循环中FFA的摄取量超过细胞在线粒体中氧化它们的能力时，其可通过多种机制诱导肝脏炎症和细胞死亡，例如ER应激、线粒体功能的修饰和OS等[4, 13]。

1.3   神经酰胺

神经酰胺作为鞘脂家族的成员，参与了细胞膜脂质双层的形成过程。据报道[14]，NASH的小鼠模型和患者血液中的神经酰胺水平均显著升高。神经酰胺结合了细胞毒性和促炎作用，与机体内胰岛素抵抗、OS、炎症和细胞死亡等生物过程密切有关。作为FFA的衍生物，肝脏中神经酰胺的产生由细胞因子(如IL-1和IL-6)介导，而神经酰胺又可以通过与TNF-α的相互作用诱发机体炎症[4]。此外，实验研究[15]表明，通过干扰神经酰胺的合成可以有效改善啮齿类动物肝脏的脂肪变性、炎症和肝细胞死亡。

研究[16]表明，肝脏的炎症反应不仅是推动NAFLD过渡到NASH的关键因素，还与促进肝纤维化和肝硬化的疾病进展密切相关。炎症的触发因素可能源于肝脏外部(例如脂肪组织或肠道)和/或内部(例如脂肪毒性、线粒体功能障碍和ER应激等)，两者对于NASH的疾病进展均具有促进作用[17]。其中，脂肪变性是肝细胞损伤和炎症的开始[17]。脂毒性期间受损的肝细胞能够释放大量促炎因子、趋化因子、细胞外囊泡和其他细胞内分子。而这些分子可以激活肝脏NPC，包括KC、HSC和LSEC以及其他免疫细胞群的募集[16]，触发炎症相关通路的活化。

2.1   Kupffer细胞

Kupffer细胞作为肝脏的常驻细胞，占肝脏NPC的20%~25%，是肝脏促炎因子的主要来源。脂质(例如FFA和FC)通过与Kupffer细胞内部或外部的受体[例如Toll样受体4 (TLR4)和肝X受体α (recombinant liver X receptor alpha，LXRα)]的相互作用来调节炎症和胰岛素抵抗[18]。TLR在Kupffer细胞上结合细胞外FFA可以激活JNK和NF-κB途径。黏附分子和单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)通过活化的NF-κB上调，从而提升活化蛋白-1 (activated protein-1，AP-1)和促炎细胞因子的转录[19]。此外，Kupffer细胞中过量的FFA会损害β氧化和线粒体的其他功能，导致线粒体的脂毒性，从而触发NF-κB/JNK途径、细胞因子和趋化因子的激活[18]，加剧肝脏炎症反应。

2.2   HSC

HSC也称脂质细胞或脂肪储存细胞，是居住在Disse空间的NPC，约占肝脏总细胞的8%。生理状态下，HSC呈现静止状态，是机体储备视黄醇的主要场所。研究[20]表明，视黄醇代谢与脂代谢密不可分。脂代谢异常可以通过细胞因子的作用刺激HSC的活化和增殖，特别是TGF-β1、TNF和脂质过氧化物等。HSC的活化会导致视黄醇以衍生物棕榈醇或硬脂醇的形式进入循环，造成机体有毒脂质的不断积累。并且HSC的活化，不仅能够促进纤维化反应，而且还能够诱导炎症信号通路(如NF-κB和AP-1)的激活和促炎细胞因子(例如CCL5和CCL20)的释放，通过细胞毒性损伤来加剧炎症反应[21]。

2.3   LSEC

LSEC是高度特化的内皮细胞，位于内脏脂肪组织和肠道血液与HSC和肝细胞之间的界面上。LSEC在人体内具有独特的表型，不仅缺乏基底膜，且具无隔膜贯穿窗孔，这些窗孔为肝细胞和血液之间的大分子(包括脂质和脂蛋白)交换建立通道。在生理条件下，LSEC是血液和肝实质之间双向脂质交换的主要调节因子，但在肝脂肪变性期间LSEC经历了形态和功能变化[22]。体外研究表明，暴露在FFA的LSEC能过激活NF-κB和TLR信号通路，刺激促炎因子的产生，导致肝脏炎症反应[23]。并且脂肪因子(包括TNF-α和IL-6)在门静脉中的循环浓度增加，也有助于LSEC炎症表型的获得[24]。

肝细胞死亡作为肝损伤最常见的表现形式之一，不仅是NASH进展的重要驱动因素，也是脂肪毒性的终点结果[25]。其中，细胞凋亡和坏死是最广泛认可的肝细胞死亡形式。众所周知，脂代谢异常是NASH疾病进展的基础。由脂毒性介导的细胞死亡被称为脂毒性凋亡，涉及内源性和外源性两种途径。其中，内在凋亡途径的激活与亚细胞功能障碍(ER应激，线粒体功能障碍和JNK激活等)密切相关，同样该途径也是Caspase介导的凋亡途径启动的重要原因。另一方面，外源性途径主要涉及几种外源性凋亡受体[死亡受体(death receptors，DR)、Fas受体和TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)受体]激活。其中，脂肪变性的肝细胞对TRAIL受体或Fas介导的细胞死亡的敏感性增加[26]。

3.1   内源性凋亡途径

3.1.1   ER应激

ER作为脂质合成和蛋白质折叠、成熟的主要部位，是NAFLD从脂肪变性进展为NASH的重要参与者[25]。ER作用于体内许多重要的细胞过程，包括蛋白质的合成、成熟、折叠和运输，脂质合成以及钙稳态的包装和调节等。这些生理过程的改变，例如由于脂质超负荷，对ER造成“压力”，会导致最初信号通路的激活，统称为“未折叠的蛋白质反应(unfolded protein response, UPR)”。研究[27-28]表明，脂毒性是NASH背景下ER应激的重要驱动因素。UPR的长期激活将触发导致细胞死亡的凋亡途径。并且，ER膜的脂质饱和度可以独立于未折叠的蛋白质激活UPR，支持脂质在ER应激反应中的直接作用[29]。

ER应激的三种主要下游介质是肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)/X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)、蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like ER kinase, PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)和转录激活因子6 (activating transcription factor 6, ATF6)，它们能够调节促凋亡基因的表达[4]。其中，IRE1可以通过募集TNF受体相关因子2和激活JNK介导细胞凋亡。PERK介导的细胞凋亡涉及下游基因转录因子CAAT/增强子结合同源蛋白(enhancer-binding homologous protein，CHOP)的激活，而活化的ATF6能够促进XBP1和CHOP的表达[29]。此外，CHOP又可通过凋亡相关基因p53上调凋亡调节因子，作用于线粒体，激活细胞死亡的线粒体途径，导致肝细胞死亡。综上所述，ER应激可通过CHOP激活或JNK信号传导诱导肝细胞凋亡[30]。

3.1.2   线粒体功能障碍

线粒体作为脂毒性的重要靶标，具有串联起内外两种凋亡途径的重要作用。研究[31]表明，线粒体功能受损是脂毒性推动NASH疾病进展的重要原因，主要体现在肝脏中脂质过氧化的增加和活性脂醛的产生。从广义上讲，脂质过氧化的后果是双重的：产生下游反应分子，如α，β多不饱和脂醛，以及随之而来的生物膜组织和结构的变化。根据脂质的不同，α，β不饱和脂醛过氧化通常会产生含醛的二次氧化产物，例如4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)、丙二醛和丙烯醛等[31]。其中，4-HNE是代谢性疾病中最常见的脂质过氧化物，能够调节几种对应激敏感的转录因子如AP-1、NF-κB和过氧化物酶体增殖物激活受体，或丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，细胞周期调节剂和caspase等信号通路来诱导细胞凋亡[32]。另一方面，多不饱和脂肪酸氧化会造成膜流动性和通透性的变化导致线粒体膜损伤。其中，线粒体内膜的心磷脂的氧化是启动线粒体凋亡的必要步骤。研究[31]表明，氧化后的心磷脂与细胞色素C的结合力降低，导致线粒体中的细胞色素C被释放到细胞质中，在胞质中与凋亡酶激活因子1结合形成寡聚体，通过其氨基端和procaspase-9的功能前区相互作用，激活caspase-3，启动caspases介导的细胞凋亡。

3.1.3   JUN激活

JNK是属于MAPK家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。JNK信号通路的激活被认为是啮齿动物和人类脂肪性肝炎中FFA诱导的肝细胞脂质凋亡的重要中枢介质。JNK共有三种亚型：JNK1、JNK2和JNK3。虽然肝细胞表达JNK1和JNK2，但饱和FFA诱导的NASH脂质凋亡似乎更依赖于JNK1亚型的表达。JNK上游在脂肪凋亡中的信号传导涉及混合性谱系激酶3和糖原合成酶激酶-3等靶点。这些靶点的激活受许多因素的调节，其中包括TNF-α和FFA[33]等。研究[34]表明，JNK在激活凋亡信号传导方面遵循两种不同的途径。在直接途径中，一方面，JNK通过在直接抑制抗凋亡蛋白Bcl2活化，从而促进细胞凋亡；另一方面，激活后的JNK通过调节促凋亡蛋白Bid和Bax易位到线粒体并从内膜空间释放细胞色素c，启动由caspase-8依赖性的凋亡途径。在间接途径中，JNK易位到细胞核，磷酸化并反式激活氨基端激酶(c-Jun)。c-Jun的磷酸化导致AP-1的形成，上调了促凋亡基因如TNF-α、Fas-L和Bak的表达。尽管方式不同，但直接和间接途径都将JNK作为中枢调节剂。

3.2   外源性凋亡受体激活

肝细胞脂质凋亡通常由质膜上的DR触发。DR主要包括FAS、TNF受体1(TNFR1)、TRAIL受体1和2(也称为DR4和DR5)。DR5在FFA诱导的肝细胞死亡中起主要作用[35]。在FFA刺激后，DR5在质膜上自我集聚并激活caspase-8，进而激活caspase-3和7的活化[36]，启动细胞凋亡。同时，这一过程中caspase-8活化导致Bid切割为截短的产物(t)-Bid，从而将细胞外死亡信号与线粒体功能障碍联系起来。此外，FFA刺激的DR5上调作用于外源性细胞死亡，还有助于释放负责细胞间通讯的细胞外囊泡。而这些囊泡被认为是NASH发病机制的潜在因素[37]。

TNF-α作为一种多效性细胞因子，可诱导细胞增殖、炎症反应和细胞死亡等多种生物效应。研究[38]表明，TNF-α介导的脂毒性肝损伤主要通过TNFR1信号传导造成。TNF-α与TNFR1的结合导致了细胞质接头蛋白和TNF受体相关因子2或受体相互作用蛋白1蛋白质复合物的形成，随后激活MAPK和NF-κB信号途径，诱导肝脏炎症反应。此外，TNF-α/TNFR1复合物还可以与接头蛋白FAS相关死亡域蛋白相互作用，从而导致caspase-8的募集和激活。而活化的caspase-8激活下游效应靶点，启动凋亡信号的传导，诱导细胞死亡[26]。

综上所述，在NASH的多因素发病机制研究中，脂毒性在诱导肝脏炎症和肝细胞凋亡方面均具有关键作用。它可以通过有毒脂质的异常堆积激活肝脏NPC，促进炎症因子(TNF-α、IL-6和TGF-β1)的释放和炎症通路(NF-κB和JNK)的激活，从而导致肝脏炎症。此外，脂毒性还通过内源性(ER应激、线粒体功能障碍和JNK)和外源性(DR5和TNFR1)两个途径激活caspase介导的凋亡信号传导，诱导细胞死亡。此次研究详细阐述了脂毒性对NASH疾病中炎症和肝细胞凋亡的具体作用机制，不仅为进一步的实验室研究提供了理论基础，还为NASH的临床诊断和治疗提供了新思路。