分子诊断技术在呼吸道感染性疾病，尤其是在全球应对新型冠状病毒大流行中发挥了重要作用，高灵敏度和高特异度的核酸扩增试验（NAAT）已成为诊断新型冠状病毒感染的参考标准。

随着基因组学、工程学和纳米科学等前沿学科的交叉融合快速发展，NAAT呈现出多种多样的检测方法和日新月异的技术手段，以PCR为基础的实时荧光PCR、多重PCR、数字PCR和等温扩增技术，以及高通量测序、基因芯片、核酸质谱、生物传感器等检测技术，在大型实验室批量检测或现场核酸即时检测（POCT）中得以广泛应用。

除呼吸道病毒外，一些技术还能检测细菌性肺炎的常见病原体及特定耐药基因。面对诸多检测方法，临床医生和微生物实验室需审慎判断何时选择何种方法或不同方法的组合，其决定因素包括流行病学、实验室资源、工作流程和检测成本等（表2）。

表2  呼吸道病原体核酸检测技术比较

实时荧光PCR技术是一种可对核酸进行定量检测的试验方法，其原理主要是通过实时采集荧光信号对核酸扩增进行监测。在PCR扩增的指数时期，模板的阈值循环（Ct）值与其起始拷贝数存在线性关系，可实现对未知样本的定量检测。

主要适用于门急诊、住院患者和大规模人群筛查，基于分子检验平台进行病原体（包括病毒、细菌、真菌、非典型病原体）的核酸检测，检测标本类型以鼻咽拭子、痰和支气管肺泡灌洗液（BALF）为主。

现有的商品化单靶标核酸检测病原体包括：新型冠状病毒、鼻病毒、嗜肺军团菌、耶氏肺孢子菌等；多靶标核酸检测病原体包括：呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌等。

作为传统的经典定量分析方法，荧光探针法的灵敏度和特异度明显优于底物发光法，但特异性引物探针的成本和对仪器的要求较高。其结果判读较为复杂，需要对扩增曲线和熔解曲线进行分析。

定量检测需验证的性能指标应包括：正确度、精密度（包括测量重复性和测量中间精密度）、不确定性、特异度（包括抗干扰能力）、灵敏度、检出限、定量限、线性区间（可报告区间）等。定性检测需验证的性能指标包括：方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等，具体性能指标以产品说明书要求为准。

相较传统PCR变温技术，等温扩增技术通常无需改变反应温度，该技术方案多、技术原理差异较大且各具优势，但基本原理仍是以特异性酶和引物进行扩增。等温扩增技术大多为指数扩增，目前多为定性检测。

主要适用于发热门诊、急诊患者上呼吸道感染病毒（如新型冠状病毒、流感病毒等）及下呼吸道感染细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）的快速筛查。

等温扩增反应通常耗时短，扩增效率高，不需要PCR循环仪且操作简单，但由于其技术的复杂性，尚难以全部直接用于临床。

技术局限性：①在引物设计上，环介导等温扩增技术、交叉引物扩增技术、链置换扩增、重组酶聚合酶等温扩增技术等较为复杂，且引物数量通常＞4条，而滚环核酸扩增技术和解旋酶依赖性扩增技术则相对容易。②需额外进行核酸提取。

通常等温扩增为定性实验，需满足中国合格评定国家认可委员会GL039定性实验的验证要求：符合率≥90%；阴性和弱阳性样本精密度检测结果完全一致；参照厂家说明进行靶基因检测，5次重复检测均应检出，20次重复检测应检出至少18次。

数字PCR是一种不依赖于核酸外标的核酸绝对定量技术。其原理是通过微流控技术，将目标核酸和PCR反应液分布在多个反应单元内进行PCR扩增，以液滴形式进行检测的方式也被称为微滴数字PCR。

该技术通过检测扩增后每个反应单元的荧光信号强度，判断含有目标核酸的反应单元个数，基于泊松分布计算起始样本中的目标核酸分子数，实现对核酸浓度的绝对定量。

可直接定量检测样本中病原体数目，尤其适用于低浓度样本、低丰度基因或突变基因的检测，也可作为质控方法评估其他分子检测产品的扩增效率。

无需标准曲线和标准品，可有效减少临床样本复杂本底对扩增的干扰，具有良好的重现性和准确度。其主要影响因素是PCR扩增和荧光信号分析，前者与PCR扩增效率、扩增体系的配置有关；后者与检测器的灵敏度、核酸拷贝数、被分割成的物理单元数以及反应单元数有关，反应单元数越多，灵敏度越高。

技术局限性：①不同数字PCR采用的微流控单元分割技术和耗材试剂具有封闭性，不同厂家试剂和平台的检测结果存在差异，尚无可评估其定量结果准确性的跨平台质控技术及非数字PCR方法学质控；②依托荧光探针进行定量检测的方法受限于靶标通量；③由于该技术检测灵敏度为单分子水平，不适用于检测浓度相对较高的样本；④数字PCR报告审核规则，尤其是低丰度检测结果的报告原则，尚无定论。

定量检测性能验证指标应包括：反应单元体积精密度、准确度、有效率；样本检测重复性、线性、动态范围、灵敏度。应使用泊松分布计算靶标分子拷贝数，不同荧光通道之间应不存在相互干扰。基于芯片的数字PCR芯片内应无气泡，阳性和阴性的随机分布应得到视觉确认。微滴数字PCR单次反应生成的最小液滴数应符合厂商建议或用户自定义值。

核酸POCT为POCT技术中涉及核酸检测的一大类技术的总称，是核酸提取技术和分子扩增技术（包括实时荧光PCR、巢式PCR、等温扩增、数字PCR等技术）的融合。其最大特点是将核酸的提取、扩增、检测均置于一个反应装置中，通过特定设备对扩增信号检测，完成对靶标核酸的筛查。目前核酸POCT主要以全自动封闭管理系统为主。

主要适用于发热门诊、急诊、ICU和某些特定病区感染患者的病原体快速检测。与传统POCT不同，呼吸道病原体核酸POCT需对检测病原体的生物安全进行评估。流感病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌等呼吸道病原体核酸POCT产品，已作为该类型代表产品问世。

核酸POCT的灵敏度和特异度高于免疫学POCT，但其成本较高。虽然大部分核酸POCT产品为封闭体系，但仍需注意PCR污染的可能性。此外，其检测设备一般较小，便于携带，但也导致其通量较低，不适用于大规模人群筛查，满足大型医院临床检测需求往往需要配备多组设备。

定性检测性能验证指标应包括：符合率≥90%；阴性和弱阳性样本精密度检测结果完全一致；靶基因5次重复检测均应检出，20次检测应至少检出18次。

定量检测性能验证指标应包括：至少 80% 的样本结果偏倚在±7.5%区间内；批内和批间精密度满足说明书范围；线性区间满足说明书范围；20 次检测中≥18个检测结果与参考值之间的偏倚在±7.5%区间内。

病原体高通量测序技术通过对临床标本中的核酸进行测序，并通过与微生物参考基因组比对获取标本中的微生物物种组成、丰度等信息。

目前该技术主要分为3类：无偏倚检测的mNGS、检测多重病原体及其耐药基因或毒力基因的tNGS和获取某一种或多种病原体全基因组数据的全基因组测序技术（WGS）。

由于病原体高通量测序技术复杂、结果解读难度大且价格昂贵，建议根据临床需求在传统微生物检测的基础上选择性使用，例如，在需尽快明确病原学诊断时、目前可及的微生物检验手段无法明确诊断时、出现聚集性呼吸道传染性病例需进行病原体溯源时使用。

病原体高通量测序技术可对标本中的核酸片段进行物种鉴定，但其物种、耐药基因和毒力基因鉴定的准确性受标本采样、实验操作流程、病原体参考基因组数据库和生物信息学分析等多种因素影响。在临床报告的解读过程中，除深入分析测序数据外，结合患者临床信息及其他实验室数据综合判断和鉴别定植菌与责任病原体亦十分关键。

实验室在开展病原体高通量测序临床检测前，需参考实验室自建方法的相关要求完成方法学建立和性能确认，结合预期临床用途确立预期性能指标，应包括：

内容节选自《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识（2023）》