巨噬细胞是单核吞噬系统的重要组成部分，其在细胞因子刺激下极化为两种不同的类型，分别是具有促炎、肿瘤抑制作用的M1型和具有抗炎性、肿瘤支持的M2型。浸润肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的巨噬细胞，被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAM)，已逐渐受到关注[1]。TAM通常是M2型抗炎免疫细胞，与恶性疾病进展、耐药性及预后不良有关。肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的75%~85%[2]。在早期HCC发展期间，由促炎巨噬细胞和肝星状细胞驱动的纤维蛋白炎症为肿瘤发生提供微环境；而在晚期HCC中，巨噬细胞极化为免疫抑制性TAM支持肿瘤进展。癌症治疗已经进入靶向免疫治疗的时代，不再限于传统的放化疗或手术切除[3]。因此，通过调节TAM寻求HCC的新型治疗策略是非常必要的。

TME是导致肿瘤细胞持续不受控制地生长、转移、免疫抑制和耐药性的原因，靶向TME是一种潜在治疗癌症的新方法。TME内含多种元素，包括基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞以及宿主与肿瘤细胞分泌的各种细胞因子、趋化因子和其他因素[4]，这些细胞间串扰可决定肿瘤的发展方向，尤其是肿瘤细胞串扰。TME中的巨噬细胞，即TAM，是大多数肿瘤中的主要浸润性免疫细胞群，具有中枢免疫调节作用，通过抑制抗肿瘤免疫反应建立一个促炎症和促肿瘤的环境，在HCC的发病机制中起着至关重要的作用[5]。TAM成为癌症免疫治疗策略一个新的目标。

1.巨噬细胞极化及其在TME中的作用

1.1   巨噬细胞极化与TME

巨噬细胞在肝脏中极为丰富，参与宿主防御、伤口愈合和免疫调节，主要分为肝脏驻留的巨噬细胞(称为Kupffer细胞)和骨髓衍生的巨噬细胞(称为单核细胞衍生的巨噬细胞)。在正常肝脏中，巨噬细胞主要以Kupffer细胞形式存在。在HCC进展期间，Kupffer细胞受到促肿瘤因子的刺激后经历表型转换成为TAM。巨噬细胞极化是由局部细胞微环境中的微生物剂和细胞因子所诱导。由于巨噬细胞的可塑性，未分化的巨噬细胞(M0)极化为两种类型：经典活化巨噬细胞(M1)和交替活化巨噬细胞(M2)[6]，如图 1所示。M1的诱导剂主要包括脂多糖(LPS)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)；而M2极化受2型辅助性T淋巴细胞(Th2)因子的影响，如白细胞介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子β(TGF-β)、糖皮质激素、免疫复合物、Toll样受体(TLR)或IL-1R配体以及白血病抑制因子激素[7]。此外，M2型可分为4种亚组(M2a、M2b、M2c和M2d)[8]。M1型巨噬细胞是具有抗炎和免疫调节作用的高效效应细胞，M2型巨噬细胞则参与促炎过程、适应性Th1免疫、组织重塑和修复以及肿瘤进展。M1和M2表型可以根据各种环境不同细胞因子的刺激进行相互转化并改变其生理功能。有研究[8]示肝癌细胞分泌的因子可触发TAM中的M2型巨噬细胞极化，表明在HCC中TAM可表达出M2样特性。

TAM是TME中最丰富的浸润性免疫细胞，主要分为2个亚组：定居在特定组织和器官中的源自胚胎造血祖细胞组织驻留的TAM以及起源于外周循环中的循环单核细胞衍生的TAM。这些细胞被募集到TME中迅速分化为巨噬细胞，TME内由宿主或肿瘤细胞分泌或表达多种调节因子也参与单核细胞衍生的TAM募集和分化。单核细胞衍生的TAM被视为经典的TAM，并通过各种信号通路刺激肿瘤细胞的增殖和生存，在肿瘤发展中发挥重要作用。由于对巨噬细胞的起源和其自身缺乏更深入地了解，组织驻留的TAM在肿瘤发生中的作用和分子机制仍有待进一步研究[5]。

TME是参与肿瘤和免疫细胞募集构建促进耐药性的致瘤环境[9]，TAM极化受到癌症类型、肿瘤阶段、临床干预影响，尤其是TME的调节。TME中的细胞因子和分子，如IFN-γ、TNF-α、单酰甘油脂酶和CD68可诱导M1-TAM极化，具有相应的抗肿瘤活性[10]。缺氧诱导因子、外周大麻CB2受体、CD163、信号转导和磷酸化的转录激活因子(STAT)以及精氨酸酶主要负责M2-TAM极性和肿瘤进展[11]。M1-TAM是抑制肿瘤的主要杀手细胞，而M2-TAM的作用是促进肿瘤的发生发展。此外，在特殊的TME中，极化TAM通常与其他免疫细胞，如自然杀伤细胞、B淋巴细胞、CD8细胞、γδT淋巴细胞或CD4CD25Foxp3调节性T淋巴细胞(Treg)相互作用，导致肿瘤的抑制或发展[12]。肿瘤组织中高水平的M1-TAM预示着癌症患者有更好的生存结果，而M2-TAM富集预示着预后不良[13]。M2-TAM浸润越多，通过诱导肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤转移和上皮-间质转化，患者临床预后越差。针对TAM，尤其是M2-TAM新兴治疗策略研究中，通过抑制单核细胞/巨噬细胞的招募或激活，可直接消除巨噬细胞，或调节巨噬细胞从M2到M1状态的极化，以清除癌细胞或进行代谢重编程[14]。

1.2   巨噬细胞极化在HCC微环境中的作用

TME是HCC中巨噬细胞极化的驱动力，导致具有免疫抑制特性巨噬细胞产生。TME中酸性pH值过高可诱导调节性TAM增强肿瘤免疫逃避的能力[15]。在HCC小鼠实验模型中发现Wnt/β-连环蛋白信号驱动巨噬细胞向M2表型分化，并在c-Myc驱动的M2极化巨噬细胞中高度表达，表明抑制HCC中Wnt蛋白分泌通过调节小鼠肿瘤的免疫微环境来防止肝脏肿瘤生长[14]。在人HCC活检组织的M2型TAM中也观察到β-连环蛋白的积累[16]。TLR4激发的先天性单核细胞炎症是HCC中IL-21+Tfh-like细胞诱导的必要条件，STAT1和STAT3的激活是Tfh-like细胞极化的关键，Tfh-like细胞在IL-21/IFN-γ依赖性信号通路中发生极化，诱导浆细胞分化，为促肿瘤性M2型巨噬细胞极化和癌症进展创造条件[17]。脊椎蛋白2及其整合素受体α4β1作为巨噬细胞吞噬的蛋白，导致抗肿瘤免疫反应，在HCC微环境招募M1-TAM亚型的过程中发挥重要作用[18]。在注射癌基因致HCC小鼠模型中，Kupffer细胞表达的miR-206通过产生趋化因子配体2(CCL2)驱动M1极化，并招募CD8+T淋巴细胞[19]。IL-6/STAT3信号通路可以调节M1/M2型巨噬细胞的极化，抗IL-6可降低细胞活力和耐药性，抑制细胞侵袭和迁移，诱导与M1或M2型巨噬细胞共培养的HCC细胞凋亡，抑制肿瘤形成和肺部转移[20]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一种由间充质样HCC细胞表达的蛋白。TGF-β在HCC中招募M2型巨噬细胞，而M2型巨噬细胞又被CTGF极化。TGF-β作为螯合剂，从外周血中招募单核细胞，而CTGF作为转化剂，将单核细胞极化为M2型巨噬细胞，刺激肿瘤的生长，并分泌CCL18促进HCC细胞迁移[21]。在HCC肿瘤细胞中的程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)在巨噬细胞中以高水平表达，其M1表型被激活，没有表现出完整的M2极化，这表明TAM表型可能无法使用经典的M1/M2模型简单地定义。

2.巨噬细胞在HCC中的作用

巨噬细胞在参与HCC的发生发展过程中至关重要。IL-1β刺激M2细胞的促迁移作用，脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)负责IL-1β的上调分泌，其依赖于活性氧和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体，表明M2细胞通过FAO依赖性过程增加了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭[22]。趋化因子CCL2 /趋化因子受体CCR2依赖性信号传导机制参与HCC发展过程。在肝癌小鼠模型中，CCR2+骨髓细胞显示出双重功能。在癌细胞分化时，CCR2+骨髓细胞通过清除衰老肝细胞抑制肿瘤发展；当进展为HCC时，抑制未成熟CCR2+骨髓细胞浸润，使自然杀伤细胞失活，促进肿瘤生长[23]。CCL2/CCR2轴的抑制导致单核细胞募集阻滞、M2极化，从而抑制CD8+T淋巴细胞介导的抗肿瘤反应。缺氧TME中肿瘤细胞与TAM之间的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/IL-1β反馈回路导致癌细胞上皮-间充质转变和体外转移。研究[24]发现，HIF-1α的稳定性增加，TAM在中度缺氧条件下分泌IL-1β增多，HCC细胞的坏死碎片通过TLR4/TRIF/NF-κB信号传导促进了具有M2表型的TAM释放IL-1β。有研究[25]证明浸润M2-TAM在TME中明显升高，产生IL-17，并且在奥沙利铂治疗后增强。IL-17A从淋巴内皮细胞协同分泌，通过肝癌干细胞PD-L1的上调促进肿瘤发生[26]。

M2巨噬细胞与HCC的“超级免疫反应”亚型有关，参与不良预后[27]。由于M-CSF/CSF1R介导的TAM侵袭，miR-148b缺乏会促进HCC的生长和转移，而HCC患者的miR-148b水平降低和TAM浸润增加与预后恶化有关[28]。Li等[29]研究发现，SIRT4在HCC巨噬细胞中表达降低，导致FAO-PPARδ-STAT3依赖性信号通路中M2的极化，SIRT4的沉默增加TAM中IL-6的产生，导致HCC肿瘤周围组织中IL-10的产生增加，致使M1巨噬细胞凋亡，表明SIRT4的下调与巨噬细胞侵袭的增加和HCC周围组织中M2-TAM的增加有关。因此，HCC患者的生存率低。高迁移率族蛋白B1的表达与IL-1β、IFN-γ和TNF-α分泌增加有关，并且与HCC患者的肿瘤周围TAM浸润和预后不良相关。研究[30]表明，肿瘤周围高迁移率族蛋白B1高表达和TAM数量与肿瘤大小及BCLC分期呈正相关，是HCC患者总生存期和无复发生存期的独立预后因素。CD206在HCC组织中的表达量高于癌周组织，而GdCl3治疗则通过下调M2型巨噬细胞中CD206的表达，抑制HCC在体外和体内的恶性潜能，表明CD206作为HCC预后生物标志物的潜在意义[31]。

Wu等[32]研究结果显示，氯曲罗利或唑来膦酸与索拉非尼联合使用消耗巨噬细胞，通过促进TAM分泌IL-12，能够增强小鼠嵌合抗原受体T淋巴细胞的抗肿瘤作用，显著抑制小鼠HCC的进展、肿瘤血管生成和转移。巨噬细胞的调控也可增强索拉非尼的抗癌活性。索拉非尼在体外通过肝细胞生长因子蛋白-Met信号通路抑制巨噬细胞介导的HCC上皮-间质转化，同时降低HCC患者的血浆肝细胞生长因子和AFP水平，抑制miR-101的表达，增强双特异性磷酸酶1的表达，并下调M2细胞中TGFβ的释放和CD206的表达，从而抑制巨噬细胞介导的HCC生长[33]。

3.HCC中巨噬细胞与邻近细胞相互作用

3.1   TAM与干细胞、自噬、趋化因子之间的串扰

肝癌干细胞(liver cancer stem cell, LCSC)是具有致瘤性和干细胞样特征的未分化细胞的微群体，常与癌症转移、复发有关。LCSC的激活与TAM分泌的细胞因子密切相关，TAM通过分泌TGF-β1促进干细胞样特性。研究[34]表明，TAM衍生的IL-6通过STAT3诱导肿瘤干细胞扩增，增强其对炎症反应的作用，促进HCC的发生。在TAM衍生的外泌体中，发现miR-125a和miR-125b的水平较低并通过靶向CD90来改善干细胞样特性。来自TAM的TNF-α通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进HCC细胞生长。SMMC-7721细胞通过Wnt/β-连环蛋白通路促进M2-TAM衍生的TNF-α机制，在与M2-TAM共培养后具有干细胞样特性[35]。

在缺氧微环境中，TAM可通过缺氧诱导因子/IL-1β/TLR4通路诱导HCC细胞上皮-间充质转化。肿瘤细胞的上皮-间质转化可能由Janus激酶2/STAT3/Snail通路分泌的IL-8触发，也可被TAM产生的TGF-β1激活[36]。肿瘤细胞中的自噬通过TAM产生的细胞因子或对细胞毒性刺激的抵抗来诱导。自噬缺陷的Kupffer细胞通过增强线粒体活性氧/NF-κB/IL-1α/β信号轴的活性促进炎症和HCC的发展。SMMC-7721和Huh-7细胞系以及HCC异种移植中的奥沙利铂细胞毒性可能被TAM激活的肿瘤细胞自噬所抑制[37]。当应用奥沙利铂治疗HCC时，M2-TAM产生更多的IL-17，促进癌细胞的自噬。

CCL15是HCC细胞中表达最丰富的趋化因子之一，可将CCR1细胞招募到HCC的TME中[38]。CCL15-CCR1的活化轴表明CCR1单核细胞和高度转移的肿瘤细胞可能侵入炎症微环境中成为HCC治疗的靶标。

TAM通过STAT3通路分泌的TNF-α将肝祖细胞转化为LCSC，TAM产生的各种细胞因子/趋化因子对巨噬细胞有重要影响，通过靶向TAM对干细胞进行干预是一种新的肿瘤免疫治疗策略。

3.2   TAM与T淋巴细胞之间的串扰

T淋巴细胞是TME中最重要的免疫细胞，可识别肿瘤相关抗原并在肿瘤破坏中发挥关键作用。CD4 T淋巴细胞不仅具有Th的辅助调节功能，还可在体内通过分泌穿孔素和颗粒酶B直接杀死缺乏主要组织相容性复合体Ⅱ类表达的肿瘤细胞。CD4 T淋巴细胞通过同源Th1活性加速M2型到M1型巨噬细胞的复极化，减少肿瘤侵袭。Treg是CD4 T淋巴细胞的亚群，通过抑制抗肿瘤免疫和促进肿瘤进展来增强肿瘤免疫逃逸。Treg可以通过作用于CD8 T淋巴细胞来改变TAM的表型。HCC小鼠模型中的肿瘤源性Treg通过抑制CD8 T淋巴细胞产生IFN-γ和促进TAM转化为M2型来调节TAM的代谢适应[39]。TAM通过下调Treg的表达对CD8 T淋巴细胞的毒性作用产生抵抗，但仍通过其独特的抗原特异性细胞毒性杀死TAM。TAM引起癌症的相关炎症，导致在HCC的TME中产生炎症辅助T淋巴细胞亚群，如T滤泡辅助细胞。TLR4诱导单核细胞的激活对于TME肝癌中具有高组织表型CXCR5+-PD-1-BTLA-CD69的滤泡辅助细胞IL-21是必需的，进而诱导浆细胞使癌症进展。肝脏IgA浆细胞在体外和体内直接抑制细胞毒性T淋巴细胞的激活，诱发细胞衰竭。研究[40]数据表明，IgA复合物刺激的单核细胞/巨噬细胞在HCC的TME中高度表达PD-L1。

TAM可抑制T淋巴细胞的功能状态。CD4 T淋巴细胞、CD8 T淋巴细胞、Treg构成免疫抑制微环境的重要驱动因素，介导TAM的代谢重塑，并影响巨噬细胞极化的方向以促进肿瘤进展。因此，靶向TAM和T淋巴细胞之间的表面标志物可能是HCC治疗中抑制免疫微环境的新机遇。

3.3   TAM和肿瘤相关嗜中性粒细胞(tumor-associated neutrophils, TAN)之间的串扰

TAN可能通过阻碍抗肿瘤免疫来促进肿瘤的进展。中性粒细胞主要通过分泌蛋白酶、产生活性氧、改变血管生成和加速转移来影响肿瘤的生长。与M1和M2型巨噬细胞类似，中性粒细胞可根据其不同功能分为N1和N2表型。TGF-β的表达使TAN分化为促进肿瘤的N2型细胞，而IFNβ促使TAN转化为抗肿瘤的N1型细胞。在HCC小鼠模型[41]中，注射TAN和肿瘤细胞的小鼠其肿瘤体积和肿瘤转移率明显增加。TAN可以分泌CCL2和CCL17来招募巨噬细胞与Treg，以诱导肿瘤侵袭和血管生成。体外进行的实验[42]表明TAN可以用同样的方式招募巨噬细胞。

单核细胞衍生的CXCL2和CXCL8在将中性粒细胞募集到肝癌TME中起到关键作用。单核细胞中的糖酵解代谢信号通过6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3/NF-κB通路介导CXCL2和CXCL8的上调[43]。促炎细胞因子IL-17促进TAN向TME募集。CCL2和CCL17是由TAN和外周血中性粒细胞强烈产生的趋化因子，它们强烈地招募巨噬细胞到HCC的TME中。此外，TAN浸润程度与HCC患者肿瘤侵袭边缘的血管生成之间存在正相关[44]。

TAN和TAM具有相似之处，通过细胞因子及炎症通路在肿瘤进展中发挥部分重叠作用，共同促进肿瘤的生长。因此，TAN浸润是一个不良的预后因素，它会进一步募集TAM，抑制肿瘤对HCC的特异性免疫。

3.4   TAM与癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)之间的串扰

CAF是TME中最丰富的非肿瘤细胞，在肿瘤生长和转移中发挥着重要作用，影响巨噬细胞招募和向M2表型的极化。在HCC中，CAF被招募并附着在巨噬细胞上，分泌GAS6以促进巨噬细胞M2型极化；向肿瘤小鼠注射人类抗体IgG78，可以特异性地减弱内分泌素对CAF与巨噬细胞相互作用的影响，从而减缓肿瘤的生长[45]。当体外培养时，来自不同肿瘤的CAF会产生大量细胞因子驱动单核细胞分化为M2型巨噬细胞，最具代表性的因子IL-6、GM-CSF已被证实在多种肿瘤疾病中存在，这两种因子的结合能够促进TAM的M2极化并影响癌症患者的预后。细胞外基质是由CAF产生的一组结缔物质，由特殊的纤维蛋白组成，与肿瘤转移的所有步骤有关。作为最重要的基质细胞，CAF决定了细胞外基质的硬度和结构。CAF和TAM之间的相互作用可以促进细胞外基质的重塑及肿瘤的转移。此外，CAF可以产生CXCL12，诱导TAM分泌血浆蛋白原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)，而TAM中PAI-1的上调加速了HCC的恶性进展。Endosialin是C型凝集素样受体家族的成员，在癌细胞和肿瘤基质细胞中特异性表达。有研究[46]表明，Endosialin主要在CAF中表达，Endosialin阳性的CAF可以通过与TAM中的CD68相互作用招募TAM，并分泌生长停滞特异性蛋白6来介导M2极化，促进HCC的进展。

肝癌TME中，CAF倾向于促进巨噬细胞的M2极化，可能由IL-6的分泌所介导。此外，CAF可生成CXCL12以诱导TAM中PAI-1的分泌，而TAM中PAI-1的上调加速了HCC的恶性进展。

4.小结与展望

TAM是一种高度异质性的细胞群，是肿瘤进展的关键组成部分，成为免疫治疗药物开发的潜在热点。对于HCC早期患者，巨噬细胞亚型具有抗肿瘤活性，因此TAM的类型和分布应根据HCC分期进一步研究，靶向TAM受体有望成为治疗HCC的有效途径。TAM在肿瘤和其他免疫细胞之间的各种串扰途径，导致肿瘤更具侵袭性。因此，阻断HCC细胞与TAM之间的恶性相互作用具有潜在的意义，深入研究巨噬细胞与TME其他成分之间的相互作用是靶向巨噬细胞治疗肿瘤的关键步骤。然而，巨噬细胞对不同环境细胞因子刺激具有高度的异质性和功能表型多样性，仅攻击一个信号轴或TAM受体不足以对癌细胞产生明确的影响。不同的免疫治疗手段组合需要进一步了解肿瘤特异性免疫，并在合适的HCC临床前模型中验证治疗靶点。目前大多数TAM研究仅限于动物模型，小鼠模型与人类在发病机制和对药物治疗的反应方面存在相当大的异质性。为了促进TAM在临床领域的应用，有必要探索靶向人TAM和肝癌患者免疫微环境的抑制剂。采用代谢组学、蛋白质组学、基因组学、表观基因组学分析的联合方法，将有助于揭示HCC特异性免疫治疗的新靶点。此外，TME中复杂的细胞相互作用，以及获得性和先天性免疫系统之间的相互作用，尚未被全面了解，可作为未来研究的重点。综上，更全面、更深入地了解肿瘤巨噬细胞表型的驱动力和HCC微环境中功能变化的驱动力，将为靶向TAM开发未来的癌症治疗方法提供巨大的帮助。