1　对象与方法

1.1　研究对象 

选取2012—2013年上海市儿童医院呼吸科门诊 中符合儿童哮喘诊断标准、年龄≥5岁的尘螨过敏哮喘患儿为尘螨病例组，同龄健康体检儿童为正常对照组，每组各62例。所有儿童均予ImmunoCAP进行外周血总IgE和特异性IgE(包括吸入、尘螨和食物)检测筛查。尘螨病例组入选标准：① 年龄5 ~ 14岁；②符合2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[7]中儿童哮喘诊断标准，患儿处于间隙发作或轻度持续发作状态；③总 IgE≥60 kU/L，尘螨特异性IgE≥0.35 kU/L以上，其 他特异性IgE<0.35 kU/L；④排除食物过敏和其他吸入变应原过敏的哮喘儿童。正常对照组入选标准： ①同龄健康体检儿童；②无喘息发作史，③总IgE  <60 kU/L，特异性IgE（吸入、食物）均<0.35 kU/L； ④排除有其他过敏症状者，如湿疹、鼻炎等。 留取所有研究对象静脉血5 mL，共124个标本。 随机选取12例哮喘儿童和12例正常儿童的血标本进行miRNA芯片检测（芯片检测组）。其余血标本参与miRNA芯片结果的验证（验证组）。 本研究得到了医院伦理委员会的批准，参与者 家属均签署知情同意书。 1.2　方法 

1.2.1标本采集及 RNA 提取　

哮喘患儿及对照组均留取静脉血标本5mL，EDTA抗凝，立即进行洗血、溶血，得到的有核细胞加 TRIzol 试剂分离提取总 RNA，存储于—80℃冰箱统一分析。其中芯片检测组24个标本行 miRNA 芯片筛查。所有样本的RNA均进行质量检测，使用Nanodrop测定RNA评估纯度； 进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA 纯度及完整性。 

1.2.2芯片杂交检测 miRNAs　

芯片杂交中采用 miRCURYTM Array Power 标记试剂盒，用标记将Hy3TM 荧光标记 miRNA，得到用于芯片杂交的荧光 探针。用 Hy3TM 标记样本按照芯片操作手册在 miRCURYTM LNA 芯片（v.18.0）杂交混合。芯片结果 使用 GenePix 4000B 芯片扫描仪扫描芯片（康成公司） 的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存。 从芯片结果中筛选出哮喘组中较对照组中表达上调 （或下调）相差至少 2 倍的所有 miRNAs。 1.2.3 miRNA 验证采用 RT-PCR 方法。对芯片存在表达异常的 miRNAs，在验证组 100 个静脉血标本中进行 qRT-PCR 验证。反转录所需的引物序列和退火温度见表 1，miRNA-U6 作为内参对照。使用莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV） 反转录酶进行反转录，RNA 酶抑制剂，10×缓冲

液（250 mmol Tris-HCl，pH值8.3，200 mmol KCl， 40 mmol MgCl2，5 mmol DTT），2.5 mmol dNTP 和 RT 引物配置的混合液 16℃ 的 30 min，42℃ 40 min 和 85℃ 5 min 进行转录反应。以 20 μL 体系的 RNA 作 为模板。合成 cDNA 在 PCR 7500 扩增仪上进行荧光 SYBR Green PCR 扩增实验。每个样本实验重复 3 次。 miRNA-27b-3p 验证选用 Exiqon 引物探针产品，以 miRNA-U6 为内参对照，进行 RT-PCR 扩增实验验证。 

1.2.4 miRNA 生物信息学分析　

用3个miRNA 预测靶基因的数据库（www.targetscan.org、http://pictar. mdc 和 www.mirbase.org）对芯片筛选出的 miRNA， 预测其在三数据库中的靶基因，取三个数据库共同 出现的靶基因分析其功能，并通过生物信息学方法， 挑选出与目标 miRNA 相关的信号通路。所需数据库 软件如下：① DAVID 功能注释与富集分析（DAVID  functional annotation and enrichment analysis,.abcc.ncifcrf.gov/）；② Genecards 数 据 库（http:// www.genecards.org/）；③ string 蛋白质功能相关网络 （string functional protein association network，http:// string-db.org/）；④Venny 软件（liveros, J.C. 2007）VENNY  http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。 

1.3　统计学分析 

对microRNA芯片结果采用聚类分析，MEV 软件 （v4.6，TIGR）。以热图表显示miRNA和样本的相互聚类分析结果。在运用DAVID软件的生物信息学分析中，gene ontology（GO）富集分析和通路分析中运 用KEGG通路分析运用Fisher检验。P表示相关功能在基因组富集显著程度，以及各个通路与表达差异基因的相关性。研究对象年龄和性别差异采用秩和检验及 pearson卡方检验；miRNA验证数据结果采取了独立样本 t 检验，P<0.05均表示差异有统计学意义。

2　结果 

2.1　研究对象一般情况

62例尘螨患儿中，男41例，女21例；年龄（6.88± 2.37）岁（5 ~ 13岁）；哮喘平均病程（3.04±1.92）年。 62例对照儿童中，男37例，女25例；年龄（6.87±2.93） 岁（5 ~ 14岁）；两组性别、年龄差异无统计学意义 （Z=0.298，χ2 =12.144，P均>0.05）。芯片组12例中男 9例、女3例，年龄（6.05±2.15）岁；验证组男9例、女3例，年龄（7.83±3.30）岁，两组差异无统计学意义 （P>0.05）。 2.2　抽取 RNA 质量检测 检测显示，所有样本RNA A260/A230比值均>1.8，接近2.0。提示所抽取样本的RNA纯度和浓度合乎标准。变性琼脂糖凝胶电泳检测结果显示28S 和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（图1）；还可观 察到1个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA （tRNA和5S核糖体RNA）组成；在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其他异型RNA组成。这些为下一步的 miRNA芯片检测可靠性提供条件

2.3 microRNA 芯片检测结果 

选取实验中在每张芯片上修正值都≥30的非对照探针做标准化，以这部分探针中值作为标准化因 子对整张芯片的点做标准化处理，即各个miRNA  修正值/中值＝标准化数据。用热图（图2）显示 miRNA和样本的聚类分析结果。图2中每行代表1个 miRNA，每列代表1个样本。miRNA聚类树显示在右侧，样本聚类树显示在顶端。聚类分析结果显示的是在样本中miRNA的表达谱。所有样本中miRNA 的原始值减去背景强度<30的样本都被排除在外。根据颜色的不同显示有差异表达，红色代表高表达，绿色代表低表达。再将热图进一步转化为数据进行分析。尘螨组较正常对照组绿色低表达较多见，如 miRNA-27b-3p、miRNA-513-5p、miRNA-22-3p等。

2.4 miRNA 表达差异统计分析结果

尘螨组和对照组之间表达差异在2倍以上、并有统计学意义的共有6个下调的miRNA：miRNA-151a- 5p、625-5p、126-3p、513a-5p、27b-3p、22-3p。

2.5 RT-PCR 验证 miRNA 

以验证组100个样本中目的miRNA和内参（U6） 分别进行RT-PCR反应。数据采用2—ΔΔCt 法进行分析 （表2）。芯片分析结果显示有异常表达的miRNA- 151a-5p、513a-5p、625-5p、126-3p、22-3p、27b- 3p，在RT-PCR验证中，在尘螨组表达也较正常对照组下降（P<0.01）。说明miRNA芯片结果和RT-PCR 验证结果一致。 

2.6 microRNA 生物信息学分析结果 

对验证成功的这6个miRNA，再通过miRBD等预测其各自的靶基因，将预测的靶基因通过DAVID软 件进行GO和代谢通路富集分析。 通过miRBD等预测下调的miRNA-151a-5p调控靶基因共有26个靶基因、miRNA-625-5p有347个、 miRNA-126-3p有1个、miRNA-513a-5p有418个、 miRNA27b-3p有679个、miRNA-22-3p有257个。同样这些靶基因也用venmiRNApan>软件进行分析，发现下调 miRNA有共同调控的靶基因。如miRNA-27b-3p与 miRNA-513a-5p和miRNA-625-5p调控1个ONECUT2 基因；miRNA-625-5p、miRNA-513a-5p、miRNA-22- 3p共同调控3个靶基因。 对这些靶基因以DAVID 软件进行功能分析， 发现下调的miRNA-513a-5p和-22-3p调控PPARGC1B （peroxisome proliferator-activated receptor gamma,  coactivator 1 beta）、CBL（Cbl proto-oncogene, E3  ubiquitin protein ligase），miRNA-27b-3p、miRNA- 513a-5p和miRNA-625-5p调控ONECUT2（one cut  homeobox 2），miRNA-625-5p和miRNA-22-3p调 控 ESR1（estrogen receptor 1），miRNA-27b-3p调 控EGFR（epidermal growth factor receptor）和SYK （spleen tyrosine kinase），miRNA513a-5p调控STAT1 （signal transducer and activator of transcription 1）。 在GO分析和KEGG通路分析中，与细胞分化和炎症因子信号通路有着显著性关联，富集值在1.9以上，差异有统计学意义（P均<0.05，表3）。同时这些靶基因的Genecards分析也显示与T 细胞和B细胞分化密切相关。这些预测的靶基因通过srting 软件分析还显示存在交互作用。通过对这些miRNA和靶基因以及相关的信号通路、下游靶基因的总结可以看到，涉及的信号通路主要集中在JAK-STAT、PI3K-AKT、MAPK、 NF-ĸB信号通路，细胞因子信号通路等（表4）。

3　讨论

环境中的过敏原是诱发和加重哮喘发病的重要因素，吸入过敏原激发试验对研究过敏性呼吸道疾病发病机制非常有用^[8]。Yamamoto等^[9]通过芯片检测发现，外周血的miRNA-192 表达降低，生物信息学分析发现miRNA-192低表达可影响几个信号通路，包括炎症信号通路和细胞分化通路。吸入性过敏原一般以尘螨为多见，是儿童哮喘发病的重要危险因素和诱发因素。本研究发现，miRNA-151a- 5p、625-5p、126-3p、513a-5p、27b-3p、22-3p在尘螨组中表达较正常组下调2倍以上，差异有统计学意义（P均<0.05）。国外已有的研究显示，miR- 126拮抗剂可有效抑制Th2细胞介导的气道炎症，以及黏液高分泌和气道高反应（AHR）^[10]。而筛选出的其他miRNA尽管目前尚未有文献证明其在哮喘发 病机制中作用，但根据miRNA的免疫调控机制，也可以推测其可能通过调控靶基因，从而影响靶基因所介导的炎症信号通路，而致哮喘发病。本研究也发现，miRNA对靶基因的调控并不是一一对应的关系。文献报道，其存在1个microRNA调控几百个靶基因mRNA，亦可几个miRNA共同调控1个靶基因 mRNA^[11]。面对miRNA数量众多的靶基因以及其对靶基因调控的复杂性，如何找出其特异性是进行下一步研究的关键。本研究运用生物信息学方法分析异常表达的miRNA，试图找出相关的靶基因，以及可能存在的炎症信号通路，为下一步验证miRNA对儿童哮喘调控机制打下基础。 生物信息学是利用应用数学、信息学、统计

学和计算机科学的方法研究生物学的问题。目前在 生物信息学分析中用到较多的是DAVID 软件，它是将芯片数据注释、可视化、整合探索的数据库。 DAVID包含了GO数据库分析和KEGG信号通路分析。其中GO数据库是提供注释和分析大量基因功能的有用工具，提供了三种详细说明术语的结构性网络来描述基因产物的特性，包括生物学过程、分子功能和细胞成分。芯片技术的运用为研究者带来了 高通量的数据，而GO可以注解这些高通量数据，并对其进行功能分类。KEGG分析（. jp/kegg/pathway.html）是描绘出蛋白质分子之间的互相作用和反应网络。在本研究中，芯片检测发现尘螨过敏哮喘患儿中差异表达的miRNA，通过miRBD 等数据库找到相应的靶基因，将这些靶基因上传至 DAVID网，获得包含上述靶基因的GO术语统计表， 以及每个基因最具代表性的GO术语和KEGG分析结果。又可以通过GeneCard数据库得到每个基因详细注释。本研究的重点是miRNA与炎症信号通路相关的基因，特别是下调的miRNA-513a-5p和-22-3p共同 调控的PPARGC1B、CBL，miRNA-27b-3p与miRNA- 513a-5p和miRNA-625-5p共同调控的ONECUT2， miRNA-625-5p和miRNA-22-3p共同调控的 ESR1， miRNA-27b-3p调控的EGFR和SYK，miRNA513-5p 调控的STAT1；通过Gene Card、GO和KEGG通路分析显示与T、B 细胞分化和炎症因子信号通路JAKSTAT、PI3K-AKT、MAPK有着显著性关联，富集显著性P均<0.05。这些信号通路与哮喘的炎症因子 IL-4、6、12、13，TNF-α及IFN分泌密切相关。 分析结果中预测的靶基因蛋白，酪氨酸激酶族的脾酪氨酸蛋白激酶（SYK）可以在信号转导的上游发挥作用。SYK可以间接通过CD19或直接作用于 3-磷脂酰肌醇激酶（PI3K），从而影响PI3K-蛋白激 酶B（PKB或AKT）信号通路^[12]，以及丝裂原活化 蛋白激酶（MAPK）和血管内皮生长因子（VEGF） 信号通路影响细胞分化、DNA修复，PI3K-AKT信 号通路又可以调控下游的转录因子NF-κB信号通路进一步影响炎性因子分泌^[13,14]。表皮生长因子受体 （EGFR）除影响MAPK、PI3K-AKT信号系统以外，又可以通过转化生长因子TGF-β和血管平滑肌细胞VEGF信号通路影响炎性因子白介素和肿瘤坏死因子等水平^[13]；此外起到负性调节作用的靶基因则有 CBL、ESR1、PPARGC1B。CBL可抑制其他靶基因 SYK和JAK、EGFR所介导信号通路的作用^[15,16]；ESR1 通过抑制下游ERK、NF-κB激活，抑制下游信号通路 NF-κB转录因子活动，从而导致炎症因子（如IL-6） 分泌降低^[17]，PPARGC1B也可以通过下游的ESR1使其所介导的下游信号通路MAPK、PI3K-AKT活动降 低^[13]。从上面的分析中也可以看到在这些靶基因之 间有着互相作用。可以设想在哮喘发病中可能不仅存在miRNA对靶基因的调控，还可能存在靶基因之间的互相作用而致儿童哮喘发病加重或缓解，也许还存在促炎和抑炎平衡的失调。 综上所述，miRNA作为免疫反应中的调节子， 在尘螨所诱导的哮喘中有重要地位。推测miRNA可 能作为基因和环境之间的调节层，影响着儿童哮喘 发生。这项研究不同于以往的哮喘易感基因研究。 以往做的较多的是全基因组扫描（GWAS），拷贝数 突变（CNV），单核苷酸多态性（SNP）顺向和反向调节突变、遗传标记等，当然其中也发现了一些有意义的基因，如DENND1B基因多态性与儿童哮喘发病有关联 ^[18,19]，但都未能很好的阐明哪些基因在是哮喘发病中起主导作用，以及基因与环境、基因与基因之间交互作用。miRNA调控靶基因mRNA表达来影响儿童哮喘发病的设想，可视为解决这些问题的 新的研究方向。 目前关于miRNA对靶基因的调控研究已很多，但以往注重的是1个miRNA对靶基因的调控作用^[4,5,9]， 而未注意miRNA 的调控功能并非一一对应，可能存在几个miRNA共调控或1个miRNA对多个靶基因调控，又或者忽略了对被调控的靶基因之间的相互作用和信号通路转导改变，不能很好地全面诠释 miRNA 的调控功能，特别其在免疫系统的调控作用。我们运用生物信息学中多个功能软件和信号通路分析系统，了解到不仅仅是多个miRNA共同对特异性靶基因的调控，更可以深入探讨这些特异性靶基因CBL、PPARGC1B、ESR1、ONECUT2、EGFR、 SYK和STAT1之间的相互作用及所涉及信号通路的转导变化，并设想miRNA通过调控靶基因表达导致下游信号通路转导的可能变化。希望运用这一分析方法，来找到一些与儿童哮喘相关的特异性miRNA的调控网络，以便更好地阐明哮喘这一复杂的多基因遗传病的分子机制。当然此分析也需要我们对研究资料的完整收集和全面分析，避免以偏概全，以及今后对分析结果的进一步验证成功。 总之，本研究初步发现了一些有意义的下调 miRNAs，特别是miRNA-625-5p、513a-5p、27b- 3p、22-3p和其所调控的靶基因CBL、PPARGC1B、 ESR1、ONECUT2、EGFR、SYK及STAT1，在炎症信号通路PI3K-AKT、MAPK、JAK-STAT等中有着重要 意义，可能通过互相作用形成一个交互网络，影响着尘螨诱导的儿童哮喘发病。而这些推测有待进一 步的体内和体外验证明确。希望通过这些研究能够 有助于阐明儿童哮喘的发病机制，开启一个儿童哮喘诊治新方向。