食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国是全球范围内发病率和死亡率最高的国家之一，食管癌疾病负担十分沉重。全球范围内，食管癌新发病例数和死亡例数分别位居恶性肿瘤第7位和第6位。其中，我国分别占全球总数的58.5%和56.8%。食管癌临床预后差，80%以上的患者在确诊时肿瘤已进展至中晚期，五年生存率不足30%，而早期诊断的食管癌患者经过根治性治疗后，其五年生存率可达90%。因此，重视和推行食管癌的早期诊断和筛查是降低食管癌发病率，改善临床预后的必由之路。

目前食管癌的早期诊断和筛查主要依靠胃镜检查。然而，内镜属于侵入性检查，过程并不舒适，且具有一定的并发症发生风险。此外，我国内镜诊疗资源配置仍然不充足，难以覆盖数以亿计的筛查目标人群。因此，研发一种简便、高效、准确的食管癌非内镜检测手段是当前亟须解决的瓶颈问题。

DNA甲基化为表观遗传修饰的一种形式，其异常修饰可发生于肿瘤的起始阶段，并可通过调控基因异常表达，促进肿瘤的发生发展。cfDNA是细胞的DNA分子进入血液循环而产生的核酸片段，可保留与其来源组织相同的表观修饰特点。因此，基于cfDNA甲基化可开发用于食管癌早期诊断的无创检测手段。李兆申院士、王洛伟教授团队在前期研究中，通过全基因组重亚硫酸盐测序、定量甲基化PCR等手段，筛选并初步测试了OTOP2和KCNA3作为食管癌早期诊断的cfDNA甲基化标志物。

图1. 基于OTOP2和KCNA3 的cfDNA甲基化检测可实现食管癌无创诊断

在此基础上，研究团队牵头开展全国多中心研究，全面评价OTOP2联合KCNA3检测食管癌的诊断效能。该研究联合全国5家三甲医院，共入组1116名受试者，其中包括334例不同分期和病理类型的食管癌患者和71例食管高级别上皮内瘤变患者。为准确评估OTOP2联合KCNA3甲基化检测的特异性，研究在入组健康受试者的同时也充分纳入了消化道良性病变和其他器官、系统恶性肿瘤患者。在该项临床研究中，OTOP2联合KCNA3甲基化无创检测手段对食管癌的敏感性和特异性分别为87.4%和93.3%，对Ⅰ-Ⅳ期食管癌的检出率分别为78.5%、87.3%、92.5%、96.9%。并且，该方法还可检出52.1%的高级别瘤变患者。此外，针对部分患者外科手术后随访发现，术前检测为阳性的患者在术后均可转为阴性。因此，OTOP2联合KCNA3甲基化检测方法具有优异的早期诊断效能，并具有应用于食管癌治疗监测的前景。

该项研究为食管癌的早期诊断和筛查提供了一项简便可行的无创检测手段，有望解决食管癌临床辅助诊断长期缺乏有效生物标志物的困境，具有巨大的临床应用前景。

自 2005年开始，我国相继开始了一系列癌症筛查和早诊早治项目。其中包括对高发地区和高危人群的食管癌筛查，采取上消化道内镜为主要筛查手段。然而，我国人口基数庞大，筛查适龄人口和风险人群总数大约5亿，而消化内镜医师和内镜诊疗设备相对缺乏，难以满足人群筛查需要。 2023年，国务院印发《健康中国行动—癌症防治行动实施方案（2023—2030年）》，要求推广癌症早诊早治，强化筛查长效机制，构建分层癌症筛查体系。因此，探索内镜检查前的非侵入性风险分层方法可能有助于提高筛查的实际应用效果。

循环游离DNA（cfDNA）是从细胞中释放到血液中的DNA。恶性肿瘤患者血浆中的一部分cfDNA可能来自肿瘤细胞并包含与来源肿瘤相同的基因变化。目前，基于cfDNA甲基化的血液活检已在肝癌、结直肠癌等的早期诊断、预后判断、用药指导等方面发挥了重要作用。但采用cfDNA甲基化进行食管癌早期诊断的相关研究仍有不足，早期诊断效能较低、缺乏外部验证和临床易用性较差等。因此，我们收集不同分期的食管癌组织样本，进行WGBS测序，以单碱基分辨率、全基因组覆盖率提供一个完备的差异甲基化标志物筛选库。并结合公共数据库开展生物信息学分析，进行差异甲基化水平分析、食管癌分期特异性分析、食管位置特异性分析及甲基化背景水平分析等，筛选出早期敏感性高、食管癌特异性的候选标志物。最终，基于血浆样本，我们采用定量甲基化PCR技术开发了基于OTOP2和KCNA3的双靶标cfDNA甲基化检测方法。我们随后开展了一项前瞻性全国多中心临床诊断试验，充分评估了该检测方法的诊断效能。

该研究为国内首个基于血浆cfDNA甲基化进行食管癌诊断的大规模临床研究，证实了基于血浆cfDNA甲基化检测食管癌的可行性和有效性。研究结果表明，该检测方法仅采用两个标志物组合即可实现对食管癌前病变和早期食管癌的优异诊断效能，有望应用于内镜前人群初筛和风险分层，提高筛查效果和效率。此外，该方法为非侵入性检测、可重复取样、受试者接受度高、临床易用性佳且不过度依赖医疗资源，具有广泛的临床应用前景。