作者：黄晶教授  广东省人民医院

       从1988年Okamoto提出HBV基因型的概念至今，全世界范围内根据HBV DNA的核苷酸序列差异将其分为A—G七个基因型．近年来HBV基因型的研究已逐渐成为国外HBV研究的热点，研究发现HBV基因型的类别与HBV传播方式、临床疾病谱、预后判断及抗病毒治疗的选择都有一定的相关性。我国约有近1．2亿慢性HBV携带者，而基因型在我国的研究开展较少。广州地区是我国慢性乙型肝炎的高发地区。本研究运用在Lindh et al.1998基因分型方法基础上改进的更为敏感的巢式聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(nested PCR—RFLP)方法，就140例不同临床表现的乙肝患者血清进行基因分型，为广州地区HBV基因型在不同临床类型患者中的分布情况提供流行病学资料。

1 材料和方法

1. 1 材料  140例不同类型乙型肝炎患者血清来自2001-01/2001-08中山大学附属第三医院传染科住院及门诊患者，慢性无症状携带者(ASC)、慢性乙型肝炎(CHB)、乙肝肝硬化(LC)、慢性重型乙型肝炎(CHG)患者分别为32、35、37、36例。诊断均符合2000年(西安)第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。并于门诊及住院患者中收集92例HBeAg(一)乙肝患者血清用于两种PCR方法的敏感性比较。

1.2 方法

1.2.1 设计引物 应用OMIGA软件分析GenBank 中各HBV基因型全基因序列，设计S区一对引物，PI：(nt2370—2389)5’一TAGAAGAAGAACTCCCTCGC；P2：(nt276-257)5’-ATTGAGAGAAGTCCACCACG。

1.2.2 巢式PCR扩增DNA片段 取50ul血清标本98℃裂解15 min，离心取上清作为模板。第一轮PCR反应，50ul反应体积中加入模板10ul，Tag DNA聚合酶2．5 U，0.2 mM dNTP，1．5 mM Mgcl2，50 mMKCl，外引物P1和P2各5 pmol，石蜡油封层后放入PCR仪进行反应，反应参数为94℃预变性3 min，94℃变性45 s，55℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，10个循环；94℃变性45 s，53℃退火1 min，72℃延伸90 s，15个循环，最后延伸7min第二轮PCR反应，50℃反应体积中加入第一轮PCR反应产物5ul作为模板内引物参考Lindh et al.报道P3(nt2823—2845：5’一TCACCATATTCTTGGGAACAAGA)和P4(nt80一61：5’一TTCCTGAACTGGACCCACCA)各10 pmol，余同第一轮PCR反应，反应参数为94℃预变性3 min，94℃变性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸90 s，10个循环；94℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，25个循环，最后延伸7 min。

1.2.3 巢式PCR阳性产物分别经AvaⅡ和DpnⅡ平行酶切 25 ul酶切反应体系包括：纯化后的PCR阳性产物各20ul，2．5ul的10×Buffer，2ul水，限制性内切酶AvaⅡ或DpnⅡ各0.5ul(5U)。于37℃孵育3 h，酶切产物及未经酶切的对照PCR产物于2％普通琼脂糖凝胶电泳，并在紫外光灯下观察结果。

1.2.4 PVR产物克隆测序 随机挑选3例血清标本的HBV病毒株，纯化的PCR产物与T载体在T4连接酶作用下16℃连接1 h，转化受体菌PUC8。经蓝白斑筛选后挑取白斑。37℃摇床培养过夜。小量提取质粒，经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切筛选阳性克隆，送检测序，由上海博亚生物技术有限公司完成。将测得序列输人DNAstar分析软件中，与Genbank中HBV基因序列进行同源性比较，明确其基因型。140例乙型肝炎患者血清中随机挑选20例进行重复实验。

1.2 .5 不同PCR方法扩增阳性率 比较92例乙型肝炎患者血清进行本实验设计的nested PCR与Lindh et al.设计PCR扩增阳性率比较。

2 结果

      随机挑选3例HBV病毒株测序所得序列与Genbank中HBV基因序列进行比较，同源性分别为B型2株(94．4—99．4％)，C型1株(94．4—97．1％)。与同标本应用本nested-PCR-RFLP分型方法的结果一致。随机挑选进行重复实验的患者血清，基因型鉴定结果符合率为100％。

      PCR与巢式PCR扩增HBV DNA的阳性率比较。共选HBeAg(-)血清92份。经原PCR方法^[3]扩增，19份血清扩增结果为阳性，阳性率为20．7％；经本文所用巢式PCR方法扩增，63份血清扩增结果为阳性，阳性率为68．5％，阳性率较前者明显提高。广州地区乙型肝炎患者的HBV基因型以C型(67．1％)和B型(30％)为主，偶见A型(2．9％)，本次检测未发现D、E、F、G及混合基因型。不同临床表现的HBeAg(+)与Anti-HBe(+)的乙肝患者血清的HBV基因型无统计学差异(P>0.05)。不同基因型的乙肝患者的年龄构成比及ALT水平也无统计学差异(P>0.05)。乙型肝炎病毒基因型在不同临床表现患者中的分布情况见下表，其总体构成比有统计学差异(P<0.05)，其中LC患者与ASC、CHB患者的基因型分布有统计学差异，前者以C型为主(分别为P<0．01，p<0．05)。而CHG与ASC、CHB、LC患者的基因型分布并无统计学差异。ASC与CHB患者的基因型分布亦无统计学差异。

3 讨论

      随着HBV基因分型方法的不断发展，目前主要有四中分型方法：全基因分析或s基因测序法；聚合酶链反应(PCR)法；聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)法；单克隆抗体酶联免疫黏附法。运用RFLP方法进行基因分型，操作较简单，经济且结果稳定，适用于流行病学调查研究。现RFLP方法已被广泛应用于基因分型。S基因中前S区异质性高，而S区相对保守，因此前S区能代表S基因的变化，提示前S基因宜于基因分型。1998年Lindh et al.通过对Genbank中51例HBV DNA序列分析发现，运用内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切前s基因即可分辨出所有已知HBV基因型，实际证明此方法是一种有效、简便的分型方法．但此方法PCR扩增Anti—HBe(+)患者血清的HBv DNA的阳性率较低，而我国大部分慢性乙型肝炎患者均为Anti—HBe(+)，因此该方法有一定的局限性。在此基础上运用巢式PCR扩增患者血清可明显增加RFLP分型方法的敏感性。HBV基因型有明确的地域性分布特征。本次检测发现广州地区乙型肝炎患者的HBV基因型以C型和B型为主，偶见A型，未发现D、E、F、G及混合基因型，与2001年上海报道相似，与同年广东的报道有一定出入，报道显示广东地区以B、c、D型为主，A、E、F型均有少量发现。既往流行病学调查报道我国HBV基因型北方以c型为主，南方以B型为主，D型仅见于少数民族地区，如西藏、新疆。A型偶有发现，无E和F型H。2001年夏国良et al对湖南、广西等四省的调查显示基因型B和C在湖南等四省为优势基因型，广西、湖南B、C型均常见，而河南和河北主要是基因型C。除河北外D型均有少量发现。因此我国HBV基因型地域性分布特征仍不甚明确，随着基因分型方法的逐渐完善、简化，更广泛、大量的流行病学调查研究有待进一步进行。近年的研究表明不同的基因型有致病性差异。本次分析的结果显示乙型肝炎病毒基因型在不同临床表现患者中的分布情况有统计学差异(P<o．05)，其中LC患者与ASC、CHB患者的基因型分布有统计学差异，前者以c型为主(分别为P<0.01，P<0.05)。另外，64．3％的B型患者的肝脏炎症较轻(包括ASC、CHB)，60．6％的C型患者则为较严重的肝脏疾病(包括LC、CHC)提示c型与B型相比，前者可能与更严重的肝损害相关．c型发展为肝硬化的可能性较大，相对B型的发展为肝硬化的可能性较小。不同的基因型的乙型肝炎的病程发展和预后有差异，这与国外多数研究结果一致。其中1999年Lindh和2002年香港大学的研究显示，基因c型与B型相比，前者更明显的与肝炎有关，HAl分值测定显示：c型者炎症分值高于B型者(P<0．01)；2000年Kao et al报道在台湾50岁以上的LC和肝细胞癌(HCC)患者与同年龄组的ASC患者比较，基因型C在前者中占主要地位；2001年有学者对上海的ASC、CHB、LC及HCC患者的血清进行了基因分型，发现基因型c所占比例依次增高，而基因型B则相反。2002年南宁和东京的报道也提示基因型c与相对严重的肝脏疾病有关，而基因型B则预后相对较好。

       本研究也发现CHG与ASC、CHB、LC患者的基因型分布并无统计学差异。而2001年王虹et al报道HCH以D型较为多见的结果不同。但本次检测例数有限，而且就HCH基因型的研究所见极少，因此更大量的研究有待进一步进行。

       分析结果还显示不同临床表现的HBeAg(+)与Anti—HBe(+)的乙肝患者血清的HBV基因型无统计学差异(P>0.05)。本次检测B型乙肝患者占总体的30％之多，不同临床表现的B型患者均不少见，ASC患者也不例外。因此并未出现国外HBeAg(+)患者以c型为主的结果。此外，不同基因型的乙肝患者的年龄构成比及ALT水平也无统计学差异(P>o．05)。未发现随着病程及年龄的延长出现某种基因型占主导地位的情况。因此无随着病程及年龄的延长发生基因型转换的提示。在欧洲有在自然条件下患者发生HBeAg(+)向Anti—HBe(+)的血清转换同时出现基因型转换的报道，而日本的研究并无类似发现。我国则缺乏此类研究的报道，随着基因分型方法学的不断完善，更进一步的研究有待在我国开展。

       因此，更广泛、更大量的研究，包括HBV基因型分布情况、与临床疾病谱及与抗病毒治疗的疗效等有待探索，这将对慢性HBV感染者的病程发展及治疗方案的选择、预后判断提供更有益的帮助。