董建华 综述 葛永纯 审校

摘 要 脓毒症是病原体感染引起宿主反应失调,导致危及生命的器官功能障碍。早期清除病原体是脓毒症救治的核心。血液净化治疗作为抑制脓毒症免疫炎症反应的辅助疗法,通常以清除细胞因子和内毒素为治疗目标,却未能改善脓毒症患者预后。新近研发的直接针对脓毒症决定因素(如病原体和宿主免疫细胞)的新型血液净化装置,可能作为脓毒症救治的有效治疗手段。

关键词 血液净化治疗 吸附 脓毒症 病原体 免疫细胞

New targets for blood purification therapies in sepsis

DONG Jianhua, GE Yongchun

National Clinical Research Center for Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing 210016, China

ABSTRACT Sepsis is defined as life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection.Blood purification therapies have been proposed as adjuvant therapies to modulate the dysregulated inflammatory response. These therapies aim mostly at removing cytokines and endotoxins from the blood. However, so far, they failed to clearly demonstrate an improvement in patient survival when evaluated in randomized trials. Recently, new blood purification devices directly targeting the primary determinants of sepsis, the pathogen itself and the host immune cells, have been developed. New devices may be an effective treatment for sepsis.

Key words blood purification therapy adsorption sepsis pathogen immune cell

脓毒症是机体对病原体感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。脓毒症治疗基于早期控制感染源、液体复苏,以及器官功能支持。随着多重耐药病原体感染发生率升高,加之新型抗菌药物缺乏,导致耐药病原体感染患者可选择药物非常有限。血液净化治疗可清除血液中病原体、内毒素和细胞因子,可参与机体免疫稳态恢复。然而,现有的随机对照研究显示,以清除细胞因子或内毒素为目标的连续性血液净化治疗并未改善脓毒症或脓毒症休克患者的预后。这可能与血液净化治疗开始时机、持续时间、患者选择、要清除的目标细胞因子等尚不明确有关。与清除免疫级联反应的下游炎症介质不同,去除病原体或活化的免疫细胞,可能是连续性血液净化治疗脓毒症更合适的靶目标。本文将对旨在去除病原体或活化的免疫细胞的新型血液净化装置的工作原理、治疗效果等研究进展作一综述。

在脓毒症早期去除血液循环中病原体,可减轻免疫级联反应和后续的细胞因子风暴。目前已经用于临床或正在开发的去除病原体的血液净化装置常用的吸附剂包括肝素、甘露糖结合凝集素(MBL)及雪花莲凝集素。

肝素吸附剂  细菌、病毒和真菌多通过其表面带正电荷的氨基酸与宿主细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素的静电作用,介导病原体黏附和侵袭的病理过程。肝素和硫酸乙酰肝素同属于糖胺聚糖家族,由重复二糖单元(葡萄糖胺、葡萄糖醛酸)构成线性链状结构,并携带高负电荷,具有相似的结构和性质,肝素也可与微生物不可逆结合。将肝素固定在介质表面,模拟哺乳动物细胞表面硫酸乙酰肝素,诱捕病原体,可实现病原体清除[1]。事实上,上述原理已经用于病毒临床检测,一种基于单壁碳纳米管网络化学电阻传感器的新型电子生物传感器,采用肝素作为生物识别元件,可超灵敏和快速地检测出登革热病毒,而不是传统的病毒抗体检测[2]。

Seraph 100血液过滤器是由美国ExThera Medical公司针对上述原理生产的一种用于吸附病原体的体外血液净化装置。该装置的功能核心是附着肝素的聚乙烯珠(直径约0.3 mm),肝素含量为2 mg/g珠,肝素与聚乙烯珠共价结合,防止肝素脱落而影响凝血功能。Seraph 100可以置于连续性肾脏替代治疗(CRRT)回路,串联于血泵和血滤器之间,也可单独行血液灌流治疗(图1)。

图1 Seraph 100血液过滤器治疗示意图

Seraph 100从血液中清除病原体的理论已经在体外试验中得到证实。肝素包被的颗粒能有效吸附各种病原体,如病毒(寨卡病毒、巨细胞病毒、腺病毒)、革兰阴性菌和革兰阳性菌,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯大肠杆菌、耐万古霉素粪肠球菌等[3-4]。普通肝素或低分子肝素也可与SARS-CoV-2病毒结合,并抑制病毒对细胞的侵袭[5]。脓毒症时,机体短时间分泌大量细胞因子,引起全身炎症反应,造成组织器官损伤。在某种程度上,细胞因子风暴对人体的损害甚至远超病原体。体外试验显示,表面肝素化的聚乙烯珠能有效吸附脓毒症患者血液中带正电荷的抗凝血酶和细胞因子,如黏附分子(VCAM)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等,TNF-α下降率超过50%[6]。

Seraph 100首次人体安全性试验,纳入15例脓毒症休克的血液透析患者,4 h治疗期间患者血压和心率稳定,氧饱和度显著提高,治疗耐受性良好,治疗期间和治疗后14 d内无不良事件发生。Seraph 100显著降低病原体负荷,其中4例菌血症患者血培养生长细菌的所需时间明显延长[7]。2019年欧盟批准Seraph 100用于清除血液中病原体或抗感染的辅助治疗。

SARS-CoV-2病毒血症与COVID-19疾病严重程度和不良预后直接相关。一项荟萃分析结果显示,病毒血症与COVID-19疾病严重程度、入住重症监护病房(ICU)、机械通气、多器官功能障碍及死亡风险密切相关[8]。Kielstein等[9]报道7例COVID-19患者接受Seraph100治疗后,血液SARS-CoV-2病毒核衣壳蛋白(N蛋白)减少,证实该装置能有效清除病毒。更重要的是,Seraph 100结合SARS-CoV-2的能力不受刺突蛋白(S蛋白)突变影响,意味着该疗法不易受病原体免疫逃逸的影响。Seraph 100治疗过程中,COVID-19患者去甲肾上腺素用量减少甚至停用,血流动力学稳定,氧合指数明显改善,死亡风险降低,并且不良事件发生率低,主要为治疗初期一过性低血压和滤器凝血[10-12]。对接受Seraph 100治疗COVID-19患者的国际登记数据初步分析表明,患者在入住ICU 60 h内接受Seraph 100治疗,可降低死亡率[13]。2020年4月,美国食品药品管理局(FDA)紧急授权Seraph 100用于清除COVID-19患者血SARS-CoV-2病毒。

抗生素在脓毒症治疗过程中发挥至关重要作用,血液净化治疗可能因抗生素清除,而抵消Seraph 100的潜在益处。一项体外试验显示,Seraph 100对氨基糖苷类药物清除率最高(庆大霉素、妥布霉素),主要发生在治疗开始5 min内,但并未观察到其他抗生素浓度明显降低[14]。Seraph 100也未影响免疫抑制剂(他克莫司、霉酚酸)血药浓度[15]。Seraph 100是迄今为止第1个用于清除脓毒症患者血液循环中致病微生物的血液净化装置,以期能够在脓毒症早期协同抗生素限制感染进展,减轻细胞因子风暴损伤。

MBL吸附剂  MBL是机体先天体液免疫的重要组成蛋白,能识别并结合病原体表面的甘露糖、N-乙酰葡萄糖、葡萄糖和岩藻糖等碳水化合物。在病原微生物感染早期、特异性抗体形成之前,MBL结合病原体、丝氨酸蛋白酶,继而激活补体或直接介导吞噬作用清除病原体[16]。通过基因工程,保留MBL的碳水化合物识别结构域(CRD),去除MBL与丝氨酸蛋白酶结合,以及与巨噬细胞表面甘露糖受体结合的结构域,确保不激活补体和促凝活性;同时将这些区域替换为IgG1的Fc区域,确保合成的FcMBL稳定。体外测试显示FcMBL保留了捕获细菌、真菌的能力,尤其是耐药菌,同时保留了结合内毒素脂多糖的能力,而促凝血和补体激活的活性明显减低。

Kang等[17]模仿人类脾脏结构,构建生物脾装置:(1)FcMBL末端生物素化,与链霉亲和素包被的磁性纳米珠结合,制成FcMBL磁性纳米珠(直径128 nm)。(2)FcMBL磁性纳米珠与菌血在螺旋管混合和孵育,病原体和内毒素与FcMBL磁性纳米珠结合。(3)再通过磁力分离通道清除致病微生物和内毒素。体外研究显示,生物脾装置能有效清除白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、混合细菌(厌氧菌和需氧菌)和脂多糖[17]。动物实验显示,生物脾装置能显著降低菌血症大鼠血液金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,减轻肺、脾和肾脏金黄色葡萄球菌侵袭,同时降低血液细胞因子白细胞介素(IL)1α、IL-4、IL-6、干扰素γ(IFN-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水平;生物脾装置提高了内毒素休克大鼠的存活率,降低肺、脾和肾脏的脂多糖和炎症细胞负荷,同时改善动物的呼吸频率和体温[17]。生物脾装置血液通道流体剪切力低于生理剪切力,红细胞破坏少,甚至降低游离血红蛋白水平;FcMBL磁性纳米珠未吸附血白细胞、血红细胞和血小板,也未影响凝血功能[17]。生物脾装置仅能清除80%未结合病原体或内毒素的FcMBL纳米磁珠,部分纳米磁珠会残留体内,存在潜在安全风险。研究者将直径1 μm未涂层超顺磁珠与128 nm FcMBL磁性纳米珠混合,可提升生物脾捕获FcMBL磁性纳米珠的能力。

在聚砜膜或聚醚砜中空纤维膜表面共价结合FcMBL,制成新型GARNET血液过滤器(图2)。该滤器可有效清除血液循环中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和脂多糖,病原体和内毒素清除率均在90%以上,并可防止脾、肺、肝和肾等器官被病原体侵袭以及炎症细胞募集。抗生素治疗会引起机体病原相关分子模式(PAMP)释放大幅增加,进而触发细胞因子级联反应,导致脓毒症休克,甚至死亡。GARNET血滤器联合抗生素治疗脓毒症,可在杀菌的同时,有效地清除PAMP,降低病原体和内毒素负荷,抑制炎症反应,稳定机体生命体征[18]。治疗前无须鉴定致病微生物,并可同时为脓毒症患者提供CRRT。

图2 GARNET血液过滤器治疗示意图

雪花莲凝集素吸附剂  病毒包膜表面富含甘露糖的糖蛋白介导病毒侵袭宿主细胞;同时脱落的糖蛋白可充当中和抗体的诱饵,增强病毒免疫逃避,糖蛋白也可结合巨噬细胞和树突状细胞诱导细胞因子释放,并增加血管通透性。雪花莲凝集素与病毒包膜糖蛋白具有高亲和力,但与大多数甘露糖结合凝集素不同,唯一能与雪花莲凝集素结合的人类血清蛋白是α2巨球蛋白。

Hemopurifier血浆滤过吸附器以雪花莲凝集素作为吸附剂,将其结合在中空纤维膜外侧,用于清除血液中病毒及可溶性糖蛋白。Hemopurifier滤器中空纤维膜孔径200 nm,病毒及可溶性糖蛋白在压力较高的血液入口端随血浆滤出,在膜外侧被雪花莲凝集素捕获、清除,而清洁血浆在压力较低的血液出口端回流至中空纤维内[19](图3)。Hemopurifier滤器可作为缺乏有效治疗手段的高致死性或高传播性病毒感染的治疗选择。

图3 Hemopurifier血浆滤过吸附器治疗示意图

虽然血液透析治疗可以清除丙型肝炎病毒(HCV),但仅能暂时降低病毒载量至初始值50%,且3～4 h后病毒载量恢复至基线水平。Hemopurifier滤器联合血液透析(3次/周)治疗HCV感染的终末期肾病患者,单个滤器HCV病毒捕获量约为8.9×108copies,治疗1周后患者HCV病毒载量降低57%,甚至在治疗结束7 d后HCV病毒载量仍在持续下降(降低82%)[20]。2014年德国医疗器械监管局批准Hemopurifier滤器用于埃博拉病毒感染治疗。一项病例报道,Hemopurifier滤器联合CRRT治疗6.5 h,血液埃博拉病毒载量从治疗前3.78×105copies/mL降至治疗后6.08×103copies/mL,单个滤器埃博拉病毒捕获量约2.53亿,治疗后患者临床症状改善,病毒抗体滴度增加,病毒载量逐步下降至测不出,患者完全康复[21]。体外研究显示,Hemopurifier滤器能有效清除中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)及马尔堡病毒(MARV)可溶性糖蛋白,治疗3 h清除率分别为60%～80%和50%～70%[19]。

免疫细胞及其产生的细胞因子是脓毒症发病机制的关键参与者。循环中激活的白细胞,尤其是中性粒细胞,在脓毒症病理生理过程中发挥核心作用。通过血液净化技术吸附去除活化的白细胞,可限制炎症部位白细胞的激活和组织浸润,以最大限度地减轻组织器官损伤和疾病进展。目前靶向清除脓毒症患者免疫细胞的血液净化装置有选择性细胞分离装置,此外,用于吸附内毒素的多黏菌素B吸附柱也具有吸附活化的白细胞,调节免疫状态的功能。

选择性细胞分离装置(SCD)  SCD的研发基于辅助肾小管装置(RAD)。在RADⅡ期临床试验中,接受枸橼酸抗凝的假RAD(未附着肾原代细胞)患者生存率反而更高[22]。SCD由聚砜膜中空纤维(分子截留量65 kD)组成,血液由滤器侧端出入,血液在中空纤维外侧流动,同时需局部枸橼酸抗凝,维持滤器后钙离子在0.2～0.5 mmol/L(图4)。脓毒症休克动物模型实验显示[23],SCD降低血液循环中白细胞和中性粒细胞计数,骨髓未成熟中性粒细胞释放减少,并抑制中性粒细胞活化,髓过氧化物酶、CD11b表达减少,细胞因子IL-6、IL-8和IL-10以及乳铁蛋白、弹性蛋白酶释放减少,同时实验动物全身血管阻力、肺毛细血管楔压和肾血管阻力降低,心输出量和肾血流量增加,血肌酐稳定、尿量增多,肺组织白细胞聚集减少。

图4 选择性细胞分离装置治疗示意图

SCD临床前研究显示,该装置清除白细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的可能机制主要包括[23](1)中空纤维膜内外侧血流剪切力不同。血液沿中空纤维膜内壁流动的剪切力约为100 dyne/cm2,而血液沿膜外壁流动的剪切力接近毛细血管剪切力<1 dyne/cm2,活化的白细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)易黏附于中空纤维膜外壁。(2)枸橼酸螯合钙离子,血液离子钙水平<0.4 mmol/L,阻断钙离子进入白细胞,抑制白细胞活化并启动白细胞凋亡机制。SCD捕获和隔离循环中激活的白细胞,改变白细胞活性,部分白细胞再以凋亡状态释放回血液循环,实现免疫调节作用,以减少组织器官损伤。

一项前瞻性、单臂、多中心临床研究[24],纳入35例接受SCD和CRRT的急性肾损伤(AKI)患者,其中80%为脓毒症、90%需机械通气,序贯器官衰竭(SOFA)评分为11.3±3.6分,SCD中位治疗时间为102.7 h,28 d和60 d全因死亡率分别为20%和31.4%,存活患者60 d均摆脱透析,脓毒症患者死亡率低于同期研究报道。一项多中心随机对照(RCT)研究[25],134例AKI和多器官功能障碍患者,其中65例患者接受SCD+CRRT,69例仅接受CRRT,SCD未改善患者60 d死亡风险。然而,对在90%以上治疗时间内保持滤器后钙离子浓度≤0.4 mmol/L的患者进行亚组分析时,发现SCD可明显改善患者死亡和透析依赖性复合终点。目前正在进行中的另一项RCT研究,计划招募200例需要CRRT的AKI重症患者,维持滤器后钙离子在0.25～0.4 mg/dL,评估SCD对AKI患者预后的影响,并探讨SCD对脓毒症和急性呼吸窘迫综合征的AKI患者的疗效[26]。

多黏菌素B吸附柱(PMX)  PMX可选择性吸附内毒素,用于革兰阴性菌引起的脓毒症休克早期阶段的治疗。PMX也能捕获活化的中性粒细胞和单核细胞,降低细胞因子高迁移率族蛋白B1、IL-6、TNF-α和凋亡因子Fas、Bax和Bcl-2水平,同时增加中性粒细胞人类白细胞抗原(mHLA-DR)表达[27-28]。因此,PMX可在细胞水平发挥免疫调节作用,不仅能清除脓毒症早期内毒素,还能改善脓毒症晚期免疫抑制状态。但PMX是否能够使脓毒症患者获益,目前尚无明确结果。EUPHAS研究表明[29],PMX可改善腹腔感染的脓毒症或脓毒症休克患者的血流动力学和器官功能障碍,降低患者28 d死亡率。然而,ABDOMIX研究和 EUPHRATES研究均未得出阳性结果。EUPHRATES事后分析显示[30],当脓毒症休克患者内毒素负荷在0.6～0.9 EU/mL时,PMX可使患者平均动脉压升高,机械通气时间缩短,28 d和90 d死亡率明显降低。因此,尚需要针对内毒素在0.6～0.9 EU/mL的脓毒症患者开展RCT研究,进一步验证PMX的临床获益。

来源：肾脏病与透析肾移植杂志订阅号