肾移植作为终末期肾病的重要治疗手段，为众多患者带来了延续生命的希望。然而，肾移植术后的免疫排斥反应始终是影响移植肾脏长期存活和患者预后的关键挑战。免疫排斥反应涉及多种免疫细胞和细胞因子的复杂相互作用。传统的免疫抑制治疗虽在一定程度上控制了排斥反应，但长期使用往往伴随着感染风险增加、药物毒性等诸多问题。因此，探寻一种更为有效、安全且具有特异性的免疫调节方法成为肾移植领域的研究热点。

2024年11月，来自浙江大学医学院附属第一医院的陈江华教授团队开发了一种可注射基因工程水凝胶，以提高移植肾脏的免疫耐受能力。研究论文“Injectable Genetic Engineering Hydrogel for Promoting Spatial Tolerance of Transplanted Kidney in Situ”发表于Advanced Science。

首先作者介绍了可注射基因工程水凝胶（iGE-Gel）的制备思路（图1）。通过将带有荧光报告基因的核定位序列增强的FOXP3基因亚克隆到慢病毒穿梭质粒上，经过慢病毒包装后转染扩增的CD4⁺T细胞，成功获得了工程化的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg细胞（Foe-Th）。随后，从Foe-Th细胞的上清液中分离出细胞外囊泡（Foe-EVs）。同时，作者还合成了硬脂酸修饰的透明质酸（HASA），其独特的化学结构能够通过疏水相互作用与Foe-EVs的膜磷脂相结合。经过多次尝试，作者最终确定了5% HASA与1×10¹⁴个EVs颗粒结合的结构为制备iGE-Gel的最优组合。

图1 iGE-Gel的制备流程

接下来，作者描述了iGE-Gel的特征（图2）。作者首先观察形态与结构，Foe-EVs呈现出均匀的直径分布（平均直径为188.29nm±20.17nm），且具有典型的双层膜微泡结构。iGE-Gel则形成具有均匀多孔结构的立体网络，这种独特的结构为其后续的功能发挥提供了重要的物理基础。作者进一步分析了iGE-Gel的蛋白组学，发现其中富含与免疫调节相关的蛋白（如CD9/CD63和TSG101等）。同时，蛋白组细胞因子阵列检测发现，iGE-Gel能够释放较高水平的免疫抑制因子（包括IL-10、IL-33和TGF-β等），这些因子在调节免疫反应中发挥着关键作用。最后作者还分析了流变学特性与稳定性，发现iGE-Gel在低频振荡时的动态振荡剪切流变学呈现固体样特征，且G′和G″无交叉，表明具有良好的弹性和稳定性。而在高剪切速率下，iGE-Gel的黏度会随着剪切率的增加而稳定下降，显示出其内部网络结构的可调节性。

此外，iGE-Gel在模拟体液中具有一定的降解特性，在PBS浸泡14天后保留9.87±0.63%的质量，同时能够持续释放Foe-EVs，且注射剪切对Foe-EVs的稳定性影响较小，确保了其在体内环境中的有效性。

图2 iGE-Gel的特征

于是，作者进一步评估iGE-Gel的生物相容性和原位肾内递送后的持续释放能力（图3）。作者首先开展体外细胞实验进行评估，发现iGE-Gel对肾小管上皮细胞系HK-2的增殖、凋亡和细胞活力没有影响。紧接着，作者进一步评估注射iGE-Gel对小鼠的影响。结果显示，iGE-Gel具有良好的可注射性，注射后无明显出血反应。在注射后28天内，心脏、肺、肝、脾和肾等器官均未出现明显病变。这说明iGE-Gel具有良好的生物相容性。随后，作者进一步将Foe-EVs用CD63-mCherry融合蛋白标记，以观察注射后肾脏中EVs信号的保留情况。结果显示，局部注射后iGE-Gel的荧光信号在14天内长期保留，表明基因工程水凝胶策略实现了生物分子的缓慢动态释放。相比之下，仅注射Foe-EVs后肾脏荧光信号迅速减弱，在注射后第三天便检测不到。

图3 评估iGE-Gel的生物相容性和持续释放能力

于是，作者进一步评估iGE-Gel对免疫反应的影响。在建立的同种异体排斥模型中，iGE-Gel不仅抑制了被膜下窦CD169⁺巨噬细胞介导的抗原呈递，还抑制了T淋巴细胞和B淋巴细胞的致敏反应，并有效降低了血清DSA滴度（图4）。

图4 iGE-Gel缓解过度的过敏反应动力学

此外，iGE-Gel还减少CD8⁺T细胞和促炎巨噬细胞浸润，促进FOXP3⁺ Treg细胞浸润，并提高了PD-L1的表达水平。这些变化有助于营造一个免疫抑制的微环境，促进移植耐受的形成。作者还观察了血管内微环境的改变，发现iGE-Gel减少了血小板的聚集和微血栓的形成（图5）。这些结果共同佐证了iGE-Gel发挥了积极的免疫调节作用。

图5 iGE-Gel发挥了积极的免疫调节作用

作者进一步评估了iGE-Gel对肾损伤的影响（图6）。结果显示，iGE-Gel在急性期不仅减轻了损伤和凋亡，还挽救了肾功能丢失和毛细血管受损；且在慢性期抑制了肾小管萎缩、肾小球基底膜增厚、肾小球硬化、足细胞融合和间质纤维化，并延长了受者的存活期（平均存活期从30.8天延长到79.3天）。

图6 iGE-Gel延长了受者生存期

为了进一步评估iGE-Gel在大型动物模型中的可行性和有效性，作者还在巴马小型猪中开展了相关实验。结果显示，iGE-Gel在猪模型中同样表现出了良好的生物安全性和可注射性。在肾移植模型中，iGE-Gel的应用也取得了显著的效果。通过对移植后7天和14天的肾活检进行病理评分发现，iGE-Gel递送后，肾小球炎和肾小管周围毛细血管评分以及肾小管炎和间质浸润评分均明显低于同种异体移植组。同时，iGE-Gel组在移植后14天的肾小球滤过率显著高于同种异体移植组，并且伴有血清肌酐和血尿素氮积累的减轻（图7）。这些结果进一步验证了iGE-Gel在大型动物模型中的有效性，为其未来在临床肾移植中的应用提供了重要的实验依据和理论支持。

图7 在小型猪开展iGE-Gel微创手术注射

来源：KidneyCode