张会健 徐映雪 汪 伟 李贵森

摘 要 目的:基于尿蛋白组学技术,筛选IgA肾病(IgAN)患者表达差异的蛋白,为探索IgAN发病机制和发现潜在生物标志物提供新的线索。方法:分析IgAN、膜性肾病及健康对照者的尿液蛋白组学数据。将膜性肾病患者和健康者作为对照,筛选出IgAN中差异表达的蛋白。筛选出蛋白Plexin-B2与临床病理指标进行相关性分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对血、尿中Plexin-B2及其配体血管生成素(ANG)表达情况进行检测验证并采用免疫组化检测其在肾脏的表达。结果:与健康对照组相比,质谱法检测的IgAN患者尿液Plexin-B2(uPlexin-B2)表达明显增加,且与总胆固醇(r=0.34,P=0.02)及低密度脂蛋白(r=0.43,P=0.01)呈正相关。uPlexin-B2与节段性肾小球硬化(r=-0.28,P=0.04)呈负相关。ELISA发现IgAN患者uPlexin-B2有升高的趋势。IgAN患者血Ang表达水平明显高于健康对照组(61.97 vs 6.30,P<0.001)。血ANG与肾毛细血管内增殖呈负相关(r=-0.40,P=0.04),与节段性硬化个数呈负相关(r=-0.44,P=0.04)。uPlexin-B2与肾脏球性硬化个数呈负相关(r=-0.95,P=0.01)。Plexin-B2及ANG均在IgAN患者肾小管中高表达。结论:IgAN患者uPlexin-B2升高。Plexin-B2及ANG与IgAN中肾小球硬化显著相关。ANG在IgAN患者血液中明显升高。本研究可能为发现IgAN的潜在生物标志物提供线索,为探索肾脏病理发病机制提供新思路。

Clinical significance of Plexin-B2 and its ligand in IgA nephropathy

ABSTRACT 

Objective：The article was based on urinary proteomics to screen for differentially expressed proteins in IgAN. It may explore the pathogenesis of IgAN and provide new clues for the discovery of potential biomarkers. 

Methodology：Urine proteomic data from patients with IgAN and membranous nephropathy, as well as healthy individuals, were analyzed. Patients with membranous nephropathy and healthy individuals were used as controls to screen for differentially expressed proteins in IgAN. The protein Plexin-B2 was to be analyzed for correlation with clinicopathological indicators. The expression of Plexin-B2 and its ligand angiogenin (ANG) in blood and urine was detected and verified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and their expression in renal tissues was detected by immunohistochemistry.

Results：Urinary Plexin-B2 (uPlexin-B2) expression was significantly increased in IgAN patients as detected by mass spectrometry compared to healthy controls. And it was positively correlated with total cholesterol (r=0.34, P=0.02) and LDL (r=0.43, P=0.01). Urinary Plexin-B2 was negatively correlated with segmental glomerulosclerosis (r=-0.28, P=0.04). A trend of elevated uPlexin-B2 in IgAN patients was found by ELISA. The expression level of ANG was significantly higher in the blood of IgAN patients than in the healthy group (61.97 vs. 6.30, P<0.001). ANG in the blood was negatively correlated with endocapillary hypercellularity (r=-0.40, P=0.04) and with the number of segmental sclerosis (r=-0.44, P=0.04). uPlexin-B2 was negatively correlated with the number of glomerulosclerosis (r=-0.95, P=0.01). Both Plexin-B2 and ANG were highly expressed in renal tubules in IgAN. 

Conclusion：Urinary Plexin-B2 was increased in patients with IgAN. Plexin-B2 and ANG were significantly associated with glomerulosclerosis in IgAN. Moreover, ANG was notably elevated in the blood of patients with IgAN. The article could provide clues for the discovery of potential biomarkers and provide new insight into the pathogenesis of renal pathology in IgAN.

IgA肾病(IgAN)是世界上最常见的原发性肾小球肾炎[1]。IgAN的病程具有高度的异质性,多数IgAN患者早期无明显症状,主要表现为尿检异常(血尿或者蛋白尿),但部分患者会缓慢进展至终末期肾病(ESKD),少数患者也可能进展迅速[1-2]。IgAN的患病率尚不清楚,我国一项2004—2014年间71 151例肾活检病例数据分析显示,IgAN是肾小球病变的主要类型,占比为28.1%,是我国ESKD的重要原因之一[3]。

尽管IgAN的发病机制及治疗有所进展[4-5],但迄今为止,尚未发现IgAN的有效生物标志物。IgAN的诊断依赖于肾活检,但肾活检并不能作为及时发现和动态监测IgAN的指标,在出现蛋白尿前潜在的肾脏损伤已经发生。尿液由肾脏产生,可以较全面地反映肾脏状态。近年来蛋白质组学的迅速发展,探索潜在生物标志物及发病机制成为研究热点[6-7]。课题组前期的研究中通过尿蛋白组学初步探索了IgAN患者尿补体与临床及病理关系,该研究表明,尿补体可以为IgAN的监测及补体相关的治疗提供线索[8]。本研究基于尿蛋白质组学分析,初步探索Plexin-B2及其配体血管生成素(ANG)在IgAN中的表达情况及临床意义,挖掘IgAN潜在的生物标志物及发病机制。

研究对象 对四川省人民医院 IgAN、膜性肾病(MN)和健康对照(HC)尿样本及IgAN临床及病理资料的收集及质谱分析在前期已完成[8]。本研究对上述数据进行生信分析筛选差异蛋白,进行相关性分析。选取2022年1月至2024年1月在四川省人民医院初诊为IgAN患者28例,微小病变型肾病(MCD)10例,HC 28例。在入选IgAN组、MCD组各选3例肾组织及3例肾癌患者癌旁组织作为对照组进行肾组织免疫组化染色。本研究经四川省人民医院伦理委员会批准[批准文号:论审(研)2024年第109号]。

纳入标准 IgAN组:肾脏活检明确诊断仅为IgAN。MCD组:肾脏活检明确诊断仅为 MCD。HC组:无肾脏病史、蛋白尿及血尿。

排除标准 合并其他全身系统性疾病:如2型糖尿病、肿瘤等,以及妊娠或哺乳期妇女。

试剂与仪器 Plexin-B2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、ANG ELISA试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司);兔二抗(美国Sigma-Aldrich);Plexin-B2抗体(成都正能生物技术有限责任公司);Angiogenin抗体(Proteintech);SpectraMax i3X酶标仪(赛默飞,美国);DP-73显微镜(日本Olympus)等。

统计学方法 采用《IBM SPSS Statistics 26.0》软件进行统计学分析,正态分布的数据以均数±标准差表示;非正态分布的计量、计数资料采用中位数(四分位间距)表示;多组间比较数据符合正态性及方差齐性用单因素方差分析,非正态分布数据采用Kruskal-Wallis H检验,采用Kruskal-Wallis 1-way ANOVA (k samples)进行多重两两比较,通过Bonferroni校正法调整显著性值。Spearman进行相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。在线数据分析平台绘图及生物信息学分析,《GraphPad Prism 9.0》绘图,《Image J》对肾脏免疫组化结果分析。

IgAN患者尿液差异蛋白的筛选 通过质谱方法一共检测尿液中1 750种蛋白质。其中IgAN中表达了1 001种,MN组有998种,HC组有1 686种。比较IgAN组与HC组尿蛋白,筛选出P<0.05且差异倍数的绝对值>2的747种差异蛋白,79种上调,668种下调(图1A);在上调及下调的差异蛋白中分别选择差异倍数大的前10种蛋白,根据其表达量绘制放射图(图1B)。根据IgAN、MN和HC组表达蛋白绘制韦恩图(图1C),有151种蛋白只在IgAN及HC组表达。将这151种蛋白与表达明显差异前20种蛋白绘制韦恩图(图1D),其中,肽基脯氨酸顺反异构酶B(PPIB)、含跨膜emp24结构域的蛋白质7(TMED7)和Plexin-B2在IgAN中表达明显,而MN中不表达。

IgAN患者尿液Plexin-B2(uPlexin-B2)与临床及病理指标的相关性 本研究分析IgAN患者uPlexin-B2与临床和病理之间的关系(表1)。uPlexin-B2与临床及病理相关性弦图(图2)。uPlexin-B2与总胆固醇(r=0.34,P=0.02)及低密度脂蛋白(r=0.43,P=0.01)呈正相关。在病理指标中,uPlexin-B2与节段性肾小球硬化(r=-0.28,P=0.04),总硬化肾小球百分比(r=-0.35,P=0.01)和肾小球节段硬化个数(r=-0.32,P=0.02)呈负相关。

表1 50例IgAN uPlexin-B2与临床及病理指标相关性

IgAN:IgA肾病;eGFR:估算的肾小球滤过率;uPlexin-B2:尿液中Plexin-B2;*：P<0.05

IgAN患者血、uPlexin-B2及其配体水平 本研究中IgAN的患者肾活检时的估算的肾小球滤过率(eGFR)为84.2±28.3 mL/(min·1.73 m2)(表2)。ELISA方法检测HC、MCD及IgAN组的血液及尿液中Plexin-B2及ANG表达情况(图3)。IgAN患者血液ANG水平明显高于HC组(61.97 pg/mL vs 6.30 pg/mL,P<0.05)。虽然Plexin-B2在各组血和尿中无明显差异,但IgAN患者uPlexin-B2均值与HC组相比仍有升高趋势(7.98 vs 6.84)。

IgAN患者Plexin-B2及其配体与临床病理相关性 28例IgAN患者血、尿中Plexin-B2、Ang与其临床病理相关性分析见表3。ANG与血红蛋白呈正相关(r=0.46,P=0.01)。Plexin-B2也与血红蛋白呈正相关(r=0.41,P=0.41)。在IgAN患者肾脏病理方面,血ANG与内皮细胞增生呈负相关(r=-0.40,P=0.04),与肾小球节段性硬化个数呈负相关(r=-0.44,P=0.04)。uPlexin-B2与肾脏球性硬化个数呈负相关(r=-0.95,P=0.01)。

表2 28例IgAN患者肾活检时的临床资料

IgAN:IgA肾病;eGFR:估算的肾小球滤过率

IgAN患者肾脏Plexin-B2及其配体表达 ANG在HC组肾脏表达呈弱阳性,在IgAN组为强阳性,在MCD组呈阳性。ANG在IgAN组及MCD组患者阳性细胞百分比高于对照组(图4A)。ANG在IgAN组肾小管及肾小球中均明显表达。Plexin-B2在HC组、MCD组肾组织中表达呈弱阳性,在IgAN组中表达呈阳性。Plexin-B2在IgAN组患者阳性细胞百分比明显高于MCD组及HC组(图4B)。Plexin-B2主要表达在肾小管。

IgAN临床表现较为隐匿,难以诊断及评估其进展情况。因此,探索IgAN发病机制及潜在生物标志物意义重大。本研究通过基于尿蛋白组学探索IgAN尿液中潜在标志物,并为IgAN的发病机制的研究提供线索。Plexin-B2是ANG功能性受体,能介导细胞内RNA加工,促进细胞生长、存活[9]。本研究发现,uPlexin-B2与IgAN患者血总胆固醇及低密度脂蛋白呈正相关。肾脏疾病常有血脂异常[10]。研究发现异位脂质与肾脏系膜细胞、足细胞和近端小管上皮细胞的结构和功能改变有关[11]。脂质代谢异常和炎症激活是足细胞损伤的显著特征,通过多种途径促进肾小球硬化和肾纤维化的进展[12]。研究发现,内皮细胞内ANG通过抑制内质网应激,调节动脉粥样硬化,可能是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点[13]。然而,有研究发现ANG是三支冠状动脉病变的新标志物,与血管造影严重程度有关[14]。Plexin-B2及其配体与血脂及动脉粥样硬化的作用机制需要进一步探索。

表3 IgA肾病患者血和尿Plexin-B2及其配体与临床及病理指标相关性

eGFR:估算肾小球滤过率;ANG:血管生成素;uANG:尿液中ANG;uPlexin-B2:尿液中Plexin-B2;*：P<0.05

本研究质谱法中uPlexin-B2与节段性肾小球硬化呈负相关。2009年牛津分型系统将系膜细胞增生、内皮细胞增生、节段性肾小球硬化和肾小球萎缩/间质纤维化确定为IgAN不良结局的危险因素,节段性肾小球硬化于2016年加入该分类[15-16]。研究表明在伴有足细胞肥大/顶部病变的节段性肾小球硬化与蛋白尿和肾功能的快速下降有关[17]。据报道,节段性肾小球硬化与蛋白尿、eGFR降低有关,在IgAN患者可独立预测预后并提供预后信息[15]。

本研究发现,在IgAN患者血液中ANG水平明显高于正常组,与内皮细胞增生和节段性硬化个数呈负相关。与正常人相比,uPlexin-B2及ANG也无明显差异,但uPlexin-B2有升高趋势。一项244例肾移植受者研究发现,ANG能反映肾脏缺血再灌注损伤的严重程度[18]。肾活检时尿ANG也是肾移植失败的风险预测因子[19]。本研究中,IgAN患者尿ANG表达并无明显差异,可能本研究中样本量较小。在未经皮质类固醇治疗IgAN患者中,内皮细胞增生与肾功能丧失更快和肾脏存活更差呈独立相关[20]。在小鼠中发现,糖皮质激素诱导长骨干骺端血管内皮细胞衰老,ANG通过Plexin-B2介导的核糖体RNA转录维持内皮细胞的增殖活性[21]。肾损伤标本中ANG表达明显上调,在人肾上皮细胞中,ANG通过诱导应激颗粒和抑制翻译促进细胞对内质网应激的适应,与野生型小鼠相比,ANG基因敲除小鼠引起的肾脏损伤程度显著增加[22]。本研究发现ANG与Plexin-B2均与肾小球硬化密切相关。Plexin-B2及其配体ANG可能在IgAN肾脏病理改变机制、生物标志物及靶向治疗的研究上可能有着巨大潜力。

来源：肾脏病与透析肾移植杂志订阅号