蔡 莉¹  侯保健¹  贺映侠²

Circular RNA_0124644 regulates microRNA-136 on renal tubular epithelial cells damage induced by high glucose

CAI Li1, HOU Baojian1, HE Yingxia2

1Department of Endocrinology, Third People’s Hospital of Hubei Province, Wuhan 430000, China

2Department of General Medicine, Wuhan Central Hospital, Wuhan 430000, China

ABSTRACT 

Objective：To investigate the effect of circular RNA_0124644 (circ_0124644) on human renal tubular epithelial cells (HK-2 cells) damage induced by high glucose (HG). 

Methodology：The plasma of 29 diabetic nephropathy patients and 41 healthy subjects were collected. The expression of circ_0124644 and microrna (Mir-136) were detected by real-time quantitative fluorescent PCR (qRT-PCR); the targeting relationship between circ_0124644 and microRNA (miR)-136 was verified.HK-2 cells were randomly divided into normal glucose (NG) group, HG group, HG+si-circ_0124644 group, HG+si-NC group, HG+si-circ_0124644+anti-miR-136 group, HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC group. The cell inhibitory rate was detected by MTT assay; apoptosis rate, Cleaved caspase-3 protein levels, interleukin (IL-6), IL-10, IL-1β, superoxide dismutase (SOD), lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), and reactive oxygen species (ROS) levels were measured. 

Results：Compared with the healthy subjects, the expression of circ_0124644 in the plasma of diabetic nephropathy patients was increased, and the expression of miR-136 was decreased (P<0.05). In HG-induced HK-2 cells, the expression level of circ_0124644 was increased, the expression of miR-136 was decreased, the cell inhibitory rate, apoptosis rate, the levels of Cleaved caspase-3 protein, average fluorescence intensity of Cleaved caspase-3, IL-6, IL-1β, LDH, MDA, and activity of ROS were increased, level of IL-10 and activity of SOD were decreased (P<0.05). After silencing circ_0124644, HK-2 cell inhibition rate, apoptosis rate, expression level of Cleaved caspase-3 protein and average fluorescence intensity of Cleaved caspase-3 were decreased, levels of IL-6, IL-1β were decreased, level of IL-10 was increased, activity of SOD was increased, level of LDH, content of MDA and activity of ROS were decreased (P<0.05). Down-regulation of miR-136 reversely weakened the effect of silencing circ_0124644 on HK-2 cells induced by HG. 

Conclusion：Silencing circ_0124644 may inhibit HG-induced renal tubular epithelial cells injury by regulating miR-136.

Key words diabetic nephropathy   circular RNA_0124644   micro RNA-136   renal tubular epithelial cells   inflammatory factors   oxidative stress   apoptosis

在糖尿病环境下,受多种因素影响,肾小管上皮细胞出现氧化应激反应、分泌多种细胞因子,导致肾间质炎症和纤维化,从而介导糖尿病肾病发生与发展,氧化应激和炎症在糖尿病肾病的发病机制中起关键作用。因此,阐明肾小管损伤的分子机制,对于确定药物干预靶点,延缓糖尿病肾病的进展具有重要意义[1-3]。研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)与糖尿病肾病的发病机制相关,可作为其诊断标志物和治疗靶点[4]。有研究报道miR-136可改善糖尿病大鼠肾纤维化[5]。环状RNA(circular RNA,circ)_0023404通过靶向抑制miR-136表达上调白细胞介素(IL)-6受体促进了缺氧/复氧刺激的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤[6]。利帕舒地尔通过上调miR-136-5p减轻视网膜色素上皮细胞的炎症损伤[7]。《Circular RNA Interactome》软件预测发现circ_0124644和miR-136有互补序列。circ_0124644在急性心肌梗死患者和缺氧诱导的心肌细胞中上调表达,沉默circ_0124644可通过调节miR-590-3p/SOX4轴减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激[8]。circ_0124644还是冠心病潜在的诊断或治疗靶点[9]。本实验以HK-2细胞为对象,探讨circ_0124644对高糖(HG)诱导的HK-2细胞损伤的影响与机制。

研究对象  收集2018年1月至2021年5月湖北省第三人民医院的29例糖尿病肾病患者及同期本院41例健康体检者的血浆(血浆收集后立即置于-80 ℃冰箱中保存)。糖尿病肾病患者中男19例、女10例,年龄28～70岁;健康体检者为对照组,男27例、女14例,年龄30～67岁。糖尿病肾病诊断标准[10]：糖尿病患者尿白蛋白/肌酐比值(UACR)≥30 mg/g或尿白蛋白排泄率(UAER)≥30 mg/24h,且3～6月重复检查UACR或UAER,3次中有2次达到或超过临界值;估算肾小球滤过率<60 mL/(min·1.73m2)在3月以上;肾活检符合糖尿病肾病病变,以上情况符合任意一种即可诊断为糖尿病肾病。两组研究对象年龄、性别差异无统计学意义。所有患者知情且签署同意书,本研究经湖北省第三人民医院伦理委员会批准(审批号:2017-001-01)。

细胞与主要试剂  HK-2细胞购自美国ATCC;DMEM培养基购自美国Hyclone公司;LipofectamineTM 3 000转染试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司;双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAT Bioquest公司;葡萄糖、MTT试剂盒、凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司;蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物;IL-6、IL-10、IL-1β酶联免疫试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;血浆RNA提取试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司;兔抗活化的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、Alexa Fluor®488偶联山羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司。

细胞处理与分组  HK-2常规培养于DMEM培养基中,分别用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基处理HK-2细胞24 h,制备糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤模型[11-12],作为HG组;用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,作为正常糖(NG)组。

采用LipofectamineTM 3 000转染试剂分别将circ_0124644干扰表达载体(si-circ_0124644),si-circ_0124644阴性对照(si-NC),si-circ_0124644与miR-136抑制剂(anti-miR-136)及阴性对照(anti-miR-NC)转染至HK-2细胞,再用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,分别为HG+si-circ_0124644组、HG+si-NC组、HG+si-circ_0124644+anti-miR-136组、HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circ_0124644、miR-136的表达水平 从-80 ℃冰箱中取出受试者的血浆样本,解冻后于4 ℃下,12 000 g离心10 min,将血浆上清液置于1.5 mL离心管中,血浆RNA提取试剂盒提取血浆总RNA;另采用Trizol试剂提取各组HK-2细胞总RNA。用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA后,根据SYBR Green试剂说明书进行qRT-PCR反应,用LightCycler 480荧光定量PCR仪对circ_0124644、miR-136的表达水平进行测定,采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列见表1。

表1 引物序列

circ_0124644:环状RNA_0124644;GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶;miR-136:微小RNA-136

双萤光素酶报告基因实验 《Circular RNA Interactome》预测显示,circ_0124644与miR-136存在碱基互补,设计野生型wt-circ_0124644与缺失miR-136结合区域的突变体mut-circ_0124644萤光素酶报告载体,将miR-136模拟物(miR-136)与miR-136模拟物阴性对照(miR-NC)分别与wt-circ_0124644、mut-circ_0124644共转染至HK-2细胞,于培养箱内培养48 h后用双萤光素酶报告基因试剂盒检测其荧光素酶活性。

甲基噻唑基四唑(MTT)法  96孔板接种各组HK-2细胞,培养48 h,添加MTT溶液(20 μL/孔),继续孵育4 h,再加二甲基亚砜(150 μL/孔)反应10 min,检测各孔光密度(OD)值,计算细胞增殖抑制率[(1-OD实验组/OD对照组)×100%]。

流式细胞术  将各组HK-2细胞洗涤并重悬,与Annexin V-FITC和PI(各5 μL)孵育10 min,上机检测细胞凋亡。

Western Blot提取各组细胞总蛋白,经过SDS-PAGE电泳分离蛋白,然后转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h,加入Cleaved caspase-3一抗(1∶1 000)与内参GAPDH抗体(1∶2 000)稀释液4℃孵育过夜,加入二抗稀释液(1∶5 000)37 ℃孵育2 h,显影、定影,分析各条带灰度值。

免疫荧光染色  HK-2细胞爬片用新鲜制备的4%多聚甲醛固定在0.01 mol/L PBS中30 min。PBS洗涤后,用10%正常山羊血清在室温下封闭1 h。然后,用兔抗Cleaved caspase-3(1∶400),在4 ℃下过夜。用PBS洗涤3次,用Alexa Fluor®488偶联山羊抗兔IgG(1∶100)。最后,用DAPI抗褪色试剂将载玻片装在抗褪色载玻片上,使用激光共聚焦扫描显微镜获取图像。使用《ImageJ》软件计算平均荧光强度(MFI)。

酶联免疫吸附测定(ELISA)  收集各组细胞培养上清液,检测IL-6、IL-10、IL-1β、SOD、LDH、MDA水平。用空白调零,酶标仪测定OD450nm值,以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度。

活性氧(ROS)检测  细胞在6孔板中孵育24 h,加入5 μmol/L DCF-DA孵育1 h后,收获HK-2细胞,PBS洗涤,在488/525 nm波长检测荧光强度,用BD FACS Calibur流式细胞仪分析ROS活性。

统计学方法  采用《GraphPad Prism》软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

circ_0124644和miR-136在糖尿病肾病患者血浆中的表达  与对照组相比,糖尿病肾病患者血浆中circ_0124644表达水平升高,miR-136表达水平降低(均P<0.001)(图1)。

circ_0124644:环状RNA_0124644;miR-136:微小RNA-136;*：与对照组比较,P<0.05

沉默circ_0124644后对circ_0124644转染效率及miR-136表达的影响  与si-NC组相比,si-circ_0124644组circ_0124644表达水平降低,miR-136表达水平升高(均P<0.001)(图2)。

circ_0124644:环状RNA_0124644;miR-136:微小RNA-136;HK-2细胞:人肾小管上皮细胞;si-circ_0124644:circ_0124644干扰表达载体;si-NC:si-circ_0124644阴性对照;与si-NC组比较,*P<0.05;ni=9

circ_0124644靶向miR-136 《Circular RNA Interactome》软件预测发现,circ_0124644和miR-136有互补序列(图3A)。miR-136与wt-circ_0124644共转染组较miR-NC与wt-circ_0124644共转染组细胞萤光素酶活性降低(P<0.001)(图3B)。

wt:野生型;mut:突变型;circ_0124644:环状RNA_0124644;miR-136:微小RNA-136;A:circ_0124644和miR-136的互补序列;B:双萤光素酶报告实验结果分析;*：与miR-NC组比较,P<0.05;ni=9

circ_0124644和miR-136对HK-2细胞损伤的影响   HG组circ_0124644表达、增殖抑制率、凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白水平和Cleaved caspase-3的MFI高于NG组,miR-136表达低于NG组(均P<0.001);HG+si-circ_0124644组circ_0124644表达、增殖抑制率、凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白水平和Cleaved caspase-3的MFI低于HG+si-NC组,miR-136表达高于HG+si-NC组(均P<0.001);与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组相比,HG+si-circ_0124644+anti-miR-136组miR-136表达降低,增殖抑制率、凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白水平和Cleaved caspase-3的MFI升高(均P<0.001)(图4)。

图4 circ_0124644和miR-136对HK-2细胞增殖、凋亡及Cleaved caspase-3表达的影响

NG:正常糖;HG:高糖;circ_0124644:环状RNA_0124644;miR-136:微小RNA-136;si-circ_0124644:circ_0124644干扰表达载体;si-NC:si-circ_0124644阴性对照;anti-miR-NC:抑制剂阴性对照;anti-miR-136:miR-136抑制剂;Cleaved caspase-3:活化的半胱氨酸蛋白酶3;GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶;MFI:平均荧光强度;A:circ_0124644表达;B,miR-136表达;C:抑制率比较;D,流式凋亡图及凋亡率比较;E:Cleaved caspase-3表达的条带图及其定量分析;F:Cleaved caspase-3表达的免疫荧光图及其定量分析;*：与NG组比较,P<0.05;#：与HG组比较,P<0.05;▲：与HG+si-NC组比较,P<0.05;△：与HG+si-circ_0124644组比较,P<0.05;■：与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组比较,P<0.05;ni=9

circ_0124644和miR-136对HK-2细胞中炎性因子的影响   HG组IL-6、IL-1β水平高于NG组,IL-10水平低于NG组(均P<0.001);HG+si-circ_0124644组IL-6、IL-1β水平低于HG+si-NC组,IL-10水平高于HG+si-NC组(均P<0.001);与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组相比,HG+si-circ_0124644+anti-miR-136组IL-6、IL-1β水平升高,而IL-10水平降低(均P<0.001)(图5)。

图5 circ_0124644和miR-136对高糖诱导的HK-2细胞中炎性因子IL-6(A)、IL-10(B)、IL-1β(C)的影响

NG:正常糖;HG:高糖;si-circ_0124644:circ_0124644干扰表达载体;si-NC:si-circ_0124644阴性对照;anti-miR-NC:抑制剂阴性对照;anti-miR-136:miR-136抑制剂;IL-6:白细胞介素-6;IL-10:白细胞介素-10;IL-1β:白细胞介素-1β;*：与NG组比较,P<0.05;#：与HG组比较,P<0.05;▲：与HG+si-NC组比较,P<0.05;△：与HG+si-circ_0124644组比较,P<0.05;■：与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组比较,P<0.05;ni=9

circ_0124644和miR-136对HK-2细胞中SOD、LDH、MDA、ROS的影响   与NG组相比,HG组SOD活性降低,LDH水平、MDA含量和ROS活性升高(均P<0.001);与HG+si-NC组相比,HG+si-circ_0124644组SOD活性升高,LDH水平、MDA含量和ROS活性降低(均P<0.001);与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组相比,HG+si-circ_0124644+anti-miR-136组SOD活性降低,LDH水平、MDA和ROS活性含量升高(均P<0.001)(图6)。

图6 circ_0124644和miR-136对高糖诱导的HK-2细胞中SOD(A)、LDH(B)、MDA(C)、ROS(D)的影响

NG:正常糖;HG:高糖;si-circ_0124644:circ_0124644干扰表达载体;si-NC:si-circ_0124644阴性对照;anti-miR-NC:抑制剂阴性对照;anti-miR-136:miR-136抑制剂;SOD:超氧化物歧化酶;LDH:乳酸脱氢酶;MDA:丙二醛;ROS:活性氧;*：与NG组比较P<0.05;#：与HG组比较,P<0.05;▲：与HG+si-NC组比较,P<0.05;△：与HG+si-circ_0124644组比较,P<0.05;■：与HG+si-circ_0124644+anti-miR-NC组比较,P<0.05;ni=9

糖尿病肾病是糖尿病严重的并发症,钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂、肠促胰素类药物等是治疗糖尿病肾病的主要方法[13]。研究显示,持续的高血糖会导致ROS的过度产生和炎症介质的激活,引起氧化应激损伤,进而导致糖尿病患者的血管和肾受损;对糖尿病肾病发生的氧化应激机制与肾炎,肾小球上皮细胞损伤之间的关系研究,可为治疗糖尿病肾病新抗氧化剂的开发提供思路[14-15]。本实验用HG处理HK-2细胞,建立糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤模型,结果显示,HK-2细胞抑制率、凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,促炎因子IL-6、IL-1β水平升高,抑炎因子IL-10水平降低,SOD活性降低,LDH水平、MDA含量和ROS活性升高;表明高糖诱导的HK-2细胞损伤模型建立成功。Wang等[16]研究报道,circ_0124644可通过下调miR-149-5p来促进PAPP-A表达,从而加剧氧化型低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞内皮损伤。circ_0124644可作为冠状动脉疾病诊断的生物标志物[17]。本实验结果显示,糖尿病肾病患者血浆中circ_0124644表达水平高于健康对照组,HG诱导的HK-2细胞中circ_0124644表达水平升高;提示circ_0124644可能与糖尿病肾病的进展有关。且沉默circ_0124644后,HK-2细胞抑制率、凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,IL-6、IL-1β水平降低,IL-10水平升高,SOD活性升高,LDH水平、MDA含量和ROS活性降低;表明沉默circ_0124644可抑制HG诱导的HK-2细胞凋亡、氧化应激和炎症反应。

众所周知,miR-136是肿瘤抑制因子之一,近年来研究发现其具有肾脏保护作用,据报道,过表达miR-136可改善脓毒症相关的急性肾损伤,同时降低氧化应激和炎症反应[18]。敲低circ_0118530通过调控miR-136抑制ROS积累、MDA水平及炎性细胞因子的释放,同时提高SOD活性[19]。另有研究显示,miR-136在糖尿病肾病患者血清和HG诱导的HK-2细胞中表达降低,上调miR-136可通过抑制adipoQ受体家族成员3(PAQR3)表达,抑制HG诱导的HK-2细胞氧化应激、纤维化和凋亡[20]。miR-136通过靶向下调脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)和抑制转化生长因子β1/Smad3信号通路改善糖尿病大鼠肾纤维化[5]。本实验发现,糖尿病肾病患者血浆中miR-136表达水平低于健康对照组;且高糖诱导的HK-2细胞中miR-136表达水平降低;这与既往的研究[20]结果类似,提示miR-136可能与糖尿病肾病的进展有关。本实验还发现,circ_0124644靶向调控miR-136;而下调miR-136逆减弱了沉默circ_0124644对HG诱导的HK-2细胞的作用。有研究显示,在糖尿病肾病中,SYK、PAQR3均是miR-136的靶基因[5,20]。故本研究推测circ_0124644可能通过miR-136调控SYK或PAQR3表达,进而影响HG诱导的肾小管上皮细胞损伤,其确切的调控作用还需进一步研究证实。

综上所述,沉默circ_0124644可能通过调控miR-136抑制HG诱导的肾小管上皮细胞损伤。本研究明确了circ_0124644可通过靶向调控miR-136表达参与糖尿病肾病进展,为糖尿病肾病的靶向治疗提供了一定的实验依据。未来将结合体内实验对circ_0124644的作用与机制进行深入验证。

来源：肾脏病与透析肾移植杂志订阅号