大量文献表明，KRAS 或 NRAS 基因外显子 2、3 或 4 突变的肿瘤对西妥昔单抗或帕尼单抗治疗基本不敏感。因此，专家组强烈建议，应对所有 mCRC 患者的肿瘤组织（原发肿瘤或转移）进行 RAS (KRAS/NRAS) 基因分型。

具有已知 KRAS 或 NRAS 突变的患者不应接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗，单独使用或与其他抗癌药物联合使用均不可，因为它们几乎没有获益的可能性，而且暴露于毒性和费用也不合理。

美国临床肿瘤学会（ASCO）发布了一份关于 mCRC 患者的扩展 RAS 测试的临时临床意见更新，与 NCCN 专家组的建议一致。ASCP、CAP、AMP 和 ASCO 制定的 CRC 分子生物标志物指南还建议 RAS 检测应与 NCCN 建议一致。

KRAS 突变是 CRC 形成的早期事件，因此，原发肿瘤的突变状态与转移之间存在非常紧密的相关性。因此，可以用原发肿瘤或转移瘤的存档标本进行 RAS 基因分型。除非无法获得来自原发肿瘤或转移瘤的存档标本，否则不应仅为了进行 RAS 基因分型而获取新鲜活检。

专家组建议，KRAS、NRAS 和 BRAF 基因检测只能在经 1988 年临床试验室改进修正案 (CLIA-88) 认证的实验室中进行，这些实验室有资格进行高度复杂的分子病理学检测。不建议使用特定的检测方法。这三个基因可以单独检测，或者可以作为 NGS 组的一部分进行检测。  就 KRAS 突变的预后价值，结果有好有坏。在 Alliance N0147 试验中，相比没有这种突变的患者，具有 KRAS 外显子 2 突变的患者的 DFS 更短。然而，此时，由于预后原因，不建议进行该检验。

De Roock 等人进行的一项回顾性研究提出了这样一种可能性，即 KRAS 的 13 号密码子突变 (G13D) 可能无法完全预测无应答。另一项回顾性研究显示了类似的结果。然而，最近对三项随机化对照 Ⅲ 期试验的回顾性分析得出结论，KRAS G13D 突变的患者不太可能对帕尼单抗产生反应。前瞻性 Ⅱ期单组试验的结果评估了西妥昔单抗单药疗法对 12 例难治性 mCRC 患者的益处，这些患者的肿瘤含有 KRAS G13D 突变。4 个月无疾病进展率的主要终点未达到 (25%)，也未见任何缓解。AGITG Ⅱ 期 ICE CREAM 试验的初步结果也没有发现西妥昔单抗单药疗法对 KRAS G13D 突变患者的益处。然而，在接受伊立替康加西妥昔单抗治疗后，9% 的伊立替康难治性人群出现了部分缓解。

8项荟萃分析得出了相同的结论：与其他 KRAS 突变的肿瘤相比，KRAS G13D 突变的肿瘤并不会更有可能对 EGFR 抑制剂有效。专家组认为，具有任何已知 KRAS 突变的患者，包括 G13D 突变，都不应该使用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。

AGITG MAX 研究中，10% 具有野生型 KRAS 外显子 2 的患者发生了 KRAS 外显子 3 或 4 突变或者 NRAS 外显子 2、3 和 4 的突变。在 PRIME 试验中，经发现，641 例没有 KRAS 外显子 2 突变的患者有 17% 发生了 KRAS 外显子 3 和 4 突变或者 NRAS 外显子 2、3 和 4 的突变。

对 PRIME 试验数据的预定义的回顾性亚组分析显示，在具有任何 KRAS 或 NRAS 突变的患者中，接受帕尼单抗加 FOLFOX 的患者的 无进展生存（PFS）期[HR = 1.31；95% 可信区间（CI）: 1.07~1.60；P = 0.008]和 总生存（OS）期（HR =1.21；95% CI :1.01~1.45；P = 0.04）相比仅接受了 FOLFOX 的患者有所减少。结果表明，帕尼单抗对 KRAS 或 NRAS 突变患者没有益处，甚至可能对这些患者产生有害影响。 

当考虑所有 RAS (KRAS/NRAS) 突变时，接受 FOLFIRI + 西妥昔单抗的 RAS 突变肿瘤患者的 PFS期 显著低于接受 FOLFIRI + 贝伐珠单抗的 RAS 突变肿瘤患者（6.1 个月 对 12.2 个月；P = 0.004）。另一方面，KRAS/NRAS 野生型肿瘤患者的 PFS期 在两种方案之间无显著差异（10.4 个月对 10.2 个月；P = 0.54）。这表明，西妥昔单抗可能对 KRAS 或 NRAS 突变患者产生有害影响。 

美国食品药品监督管理局（FDA) 更新了帕尼单抗的适应证，指出帕尼单抗不适用于联合奥沙利铂类化疗来治疗 KRAS 或 NRAS 突变阳性疾病患者。NCCN 结肠/直肠癌专家组认为，RAS 突变状态应在诊断 Ⅳ 期疾病时确定。具有任何已知 RAS 突变的患者都不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗进行治疗。

虽然 RAS 突变表明对 EGFR 抑制剂没有反应，但含有野生型 RAS 基因的许多肿瘤仍然对这些治疗无应答。因此，有研究已经将 RAS 下游的因素作为可预测西妥昔单抗或帕尼单抗反应的可能的额外生物标志物。

约 5%-9% 的 CRC 以 BRAF 基因 (V600E) 的特异性突变为特征。出于所有实际目的，BRAF 突变仅限于无 RAS 突变的肿瘤。非突变 BRAF 基因的蛋白产物的激活发生在 EGFR 通路中已激活的 KRAS 蛋白的下游。突变的 BRAF 蛋白产物被认为具有组成性活性，从而可以推测绕过了西妥昔单抗或帕尼单抗对 EGFR 的抑制。 

mCRC 患者（接受一线治疗）的非计划性回顾性亚组分析的有限数据表明，尽管 BRAF V600E 突变无论采用何种治疗都会导致预后不良，但在一线治疗中添加西妥昔单抗可能对具有该突变特征的患者有一些益处。对 PRIME 试验的一项计划性亚组分析还发现，BRAF 突变提示预后不良，但不能预测在 mCRC 的一线治疗中将帕尼单抗添加至 FOLFOX 的益处。

另一方面，随机化 Ⅲ 期医学研究委员会 (MRC) COIN 试验的结果表明，西妥昔单抗可能对 BRAF 突变肿瘤患者（采用 CAPEOX 或 FOLFOX 一线治疗）无作用，甚至产生有害影响。

 在后续的治疗中，回顾性证据表明，在转移性疾病的非一线治疗中，突变的 BRAF 是抗 EGFR 治疗耐药的标志。一项对化疗难治性疾病患者的 773 个原发性肿瘤样本的回顾性研究表明，BRAF 突变导致的对西妥昔单抗的客观有效率 (2/24; 8.3%) 显著低于野生型 BRAF 肿瘤 (124/326; 38.0%; P = 0.0012)。此外，多中心随机化对照 PICCOLO 试验的数据与该结论一致，提示在一小部分 BRAF 突变患者的非一线治疗情况中，将帕尼单抗添加至伊立替康会造成损害。

2015 年发表的一项荟萃分析确定了 9 项 Ⅲ 期试验和 1 项 II 期试验，这些试验将西妥昔单抗或帕尼单抗与标准治疗或最佳的支持性治疗进行比较，其中包括 463 例伴有 BRAF 突变的转移性结直肠癌患者（一线、二线或难治性治疗）。相比对照组，添加 EGFR 抑制剂并没有改善 PFS期（HR = 0.88；95% CI ：0.67~.14；P = 0.33）、OS期（HR = 0.91；95% CI ：0.62~1.34；P = 0.63）或 客观有效率（ORR）（RR= 1.31；95% CI ： 0.83~2.08；P = 0.25）。类似地，另一项荟萃分析确定了 7 项 RCT，发现西妥昔单抗和帕尼单抗并没有改善 BRAF 突变患者的 PFS期（HR= 0.86；95% CI： 0.61~1.21）或 OS期（HR =0.97；95% CI ： 0.67~1.41）。

除作为 BRAF 靶向治疗的预测标志物外，很明显 BRAF 突变是强有力的预后标志物。一项对来自Ⅱ期和 Ⅲ 期结肠癌患者（入组 PETACC-3 试验）的组织的前瞻性分析表明，BRAF 突变对 MSI-L 或 MSS 肿瘤患者的 OS期具有预后意义（HR = 2.2；95% CI = 1.4~3.4；P = 0.0003）。

此外，CRYSTAL 试验的最新分析显示，相比具有野生型基因的患者，携带 BRAF 突变的转移性结直肠肿瘤患者的预后更差。BRAF 突变状态可以预测 AGITG MAX 试验中的 OS期，HR = 0.49（95% CI ： 0.33~0.73；P = 0.001）。COIN 试验中 BRAF 突变患者的 OS期 为 8.8个月，而 KRAS 外显子 2 突变的患者和野生型 KRAS 外显子 2 肿瘤患者的 OS 期分别为 14.4 个月和 20.1 个月。

此外，对 N0147 和 C-08 试验的二次分析发现，BRAF 突变与已切除的 Ⅲ 期结肠癌复发后的存活期较差显著相关，与位于远端结肠的原发性肿瘤有更强的相关性。最近对 21 项研究（包括 9885 例患者）的系统性综述和荟萃分析的结果表明，BRAF 突变可能伴随特定的高危临床病理特征。尤其，观察到 BRAF 突变与近端肿瘤位置（OR 为 5.22；95% CI 为：3.80~7.17；P < 0.001）、T4 肿瘤（OR 为 1.76；95% CI ： 1.16~2.66；P = 0.007）和不良分化（OR 为 3.82；95% CI ： 2.71~5.36；P < 0.001）之间具有相关性。

总之，专家组认为，越来越多的证据表明，BRAF V600E 突变对帕尼单抗或西妥昔单抗（作为单一药物或联合细胞毒性化疗）产生应答的可能性极低，除非作为 BRAF 抑制剂方案的一部分给药。专家组建议，在诊断Ⅳ 期疾病时对肿瘤组织（原发性肿瘤或转移瘤）进行 BRAF 基因分型。BRAF V600E 突变检测可在福尔马林固定的石蜡包埋组织上进行，通常采用 PCR 扩增和直接 DNA 序列分析的方法进行。等位基因特异性 PCR、NGS 或 IHC 是检测该突变的其他可接受方法。 

 HER2 是与 EGFR 相同的信号激酶受体家族的成员之一，在乳腺癌的晚期和辅助治疗中，已可以成功地对其进行靶向攻击。HER2 在 CRC 中很少扩增/过表达（总体约为 3%），但在 RAS/BRAF 野生型肿瘤中发生率较高（据报道为 5%~14%）。

已有人提出将特异性分子诊断方法用于 CRC 的 HER2 检测，现在，推荐 HER2 靶向治疗作为后续治疗方案，用于 RAS/BRAF 野生型和 HER2 过表达的肿瘤患者（见以下HER2 扩增性疾病的全身治疗方案）。基于此，NCCN指南建议对 mCRC 患者进行 HER2 扩增检测。如果已知肿瘤有 KRAS/NRAS 或 BRAF 突变，则不需要进行 HER2 检测。由于 HER2 靶向治疗仍在研究中，鼓励患者参加临床试验。

三个 NTRK 基因编码原肌球蛋白受体激酶 (TRK) 蛋白质。TRK 的表达主要在神经系统中，这些激酶有助于调节疼痛、对运动/位置的感知、食欲和记忆。NTRK 基因融合引起 TRK 融合蛋白地过表达，导致下游信号具有组成性活性。

最近的研究估计大约 0.2% 到 1% 的 CRC 携带 NTRK 基因融合。一项 2314 个 CRC 标本（其中 0.35% 有 NTRK 融合）的研究发现，NTRK 融合限于野生型 KRAS、NRAS 和 BRAF 癌症。

此外，大多数含有 NTRK 融合的 CRC 也存在 MMR 缺陷。这些结果可能支持将 NTRK 融合检测限于野生型 KRAS、NRAS 和 BRAF 的患者。TRK 抑制剂是 NTRK 基因融合阳性的 mCRC 患者的治疗选择。

 TMB 测量肿瘤基因组给定编码区域内体细胞编码突变的总量，并且可使用 NGS 技术进行定量。研究已确定 TMB 是免疫治疗反应的潜在生物标志物，并且 FDA 已批准帕博利珠单抗用于既往治疗后进展且无令人满意的替代治疗选择的不可切除或转移性高 TMB (TMB-H) 实体瘤患者。标签中通过 FDA 批准的检测将 TMB-H 定义为 10 个或更多突变/兆碱基。该批准是基于入组晚期实体瘤患者的Ⅱ期 KEYNOTE-158 研究结果。

接受帕博利珠单抗治疗的 TMB-H 肿瘤患者的 ORR 为 29%，而非 TMB-H 肿瘤患者的 ORR 为 6%。然而，在本研究中接受疗效评价的 796 例患者中，无患者患有结直肠癌。Ⅱ期 TAPUR 篮子研究摘要报告了 27 例接受帕博利珠单抗治疗的 TMB-H 晚期 CRC 患者的结果。报告了 1 例部分缓解和 7 例疾病稳定至少 16 周的病例，疾病控制率为 28%，ORR 为 4%。

基于结直肠癌人群中的有限数据，NCCN 专家组目前不建议进行 TMB 生物标志物检测，除非作为临床试验的一部分进行测量。