施毅教授介绍，侵袭性真菌感染（IFI）的发病率高、病死率高，绝大多数为院内感染。肺部真菌病中常见的病原体为隐球菌、曲霉菌和念珠菌。近5年来，国内外多部侵袭性真菌病（IFD）相关指南陆续更新，我国《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第六次修订版）》将IFD 的三级诊断定义为“确诊、临床诊断及拟诊”，而真菌病原学检查是临床诊断和确诊的“金标准”。

在疑似诊断患者中，主要通过临床标本的常规检测（例如涂片镜检和培养）、生物标志物[例如1-3-β葡聚糖（G）和半乳甘露聚糖抗原（GM）检测]和分子生物学[例如聚合酶链式反应（PCR）对真菌DNA扩增和基因测序]获得诊断。分泌物涂片镜检是基础检查，通过培养方法对真菌进行鉴定的敏感性较低，但该方法有助于提供流行病学和真菌药敏的信息；血清GM 抗原定量检测应用于中性粒细胞缺乏和未接受预防治疗的患者；血清G试验应用于念珠菌血症的检测；PCR诊断已经被广泛应用，或许有助于改善患者的真菌诊断；mNGS也开始用于临床，但仍需要进一步推进该方法的标准化和一致性。

欧洲既往的真菌病诊断采纳了GM和G试验检测，但没有采纳真菌核酸检测。2008年后，使用GM检测诊断侵袭性曲霉菌病（IA）的数量显著增加，G试验检测也被广泛应用；国际人类和动物真菌协会真菌PCR倡议工作组（FPCRI）经过严格验证后，在曲霉PCR检测技术标准方面已经取得重大进展。

一项发表于2015年的研究显示，在组织病理学观察到存在真菌时，真菌DNA的PCR扩增技术联合DNA测序将有助于进一步早期鉴定真菌菌种；一项西班牙的研究结果显示，PCR可检测到132例IFD患者中的28种不同真菌，且同时还检测到多种新出现或罕见菌株；一项发表于《美国临床病理学杂志》（Am J Clin Pathol）的研究显示，针对培养阴性的IFD患者，DNA测序技术可用于明确致病菌，且有助于缩短真菌菌株识别时间、指导临床真菌治疗，同时明确IFD的发病机制。

欧洲医学真菌学联盟(ECMM)2020年发布的《临床真菌实验室内突破性真菌感染的诊断共识声明》中对PCR在曲霉菌（IA）中的诊断建议为：①血浆、血清或全血连续2次或以上PCR检测阳性；②支气管肺泡灌洗液（BALF）重复2次或以上PCR检测阳性；③血浆、血清或全血至少1次PCR检测阳性，同时BALF至少1次PCR检测阳性（符合任意1条即可）。

2019年，欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MSG）发布的《侵袭性真菌病定义共识》中将IFD 的确诊标准新增了“组织核酸”诊断方法：对于福尔马林固定-蜡块包埋的组织标本，在病理阅片见真菌结构后，可送至微生物实验室进行组织脱蜡、核酸提取、PCR 特异性扩增真菌 DNA 并测序，以进行酵母菌/霉菌菌种鉴定。

 美国胸科学会（ATS）《微生物实验室检测在肺科和ICU内诊断真菌感染的应用指南（2019 ）》中关于PCR在IA中的诊断建议：①对于严重免疫功能低下，例如血液恶性肿瘤、接受造血干细胞移植、实体器官移植的患者，疑似存在侵袭性肺曲霉菌病（IPA）时，建议应用血液或血清曲霉PCR检测（强推荐，高级质量证据）；②对于严重免疫功能低下，例如血液恶性肿瘤、接受造血干细胞移植、实体器官移植的患者，建议进行BALF（包含曲霉）PCR的检测作为评估的一部分（强推荐，高级质量证据）；③对于严重免疫功能低下，例如血液恶性肿瘤、接受造血干细胞移植、实体器官移植的患者，如果强烈怀疑存在IPA，但IPA检测结果为阴性是，建议考虑进行活检和/或包含或不包含PCR或GM检测的附加检测（有条件推荐，低级质量证据）。

施毅教授总结道：①分子生物学检测已经成为真菌感染病原学检测的重要方法；②PCR检测已经广泛应用于临床，部分可以作为真菌感染的诊断依据；③mNGS目前刚刚在临床普及，正在积累经验，可以作为辅助诊断的指标，但尚不能作为病原学的诊断依据；④mNGS给临床提供了一种有敏感性、有特异性、有意义的病原微生物检测方法，并且mNGS对于某些类型真菌的检测敏感度高于传统方法（例如曲霉菌）；⑤mNGS可检测真菌耐药基因。

①不需要培养，节省时间；②相较传统方法（G/GM试验），可以精确区分物种，甚至亚型；③在某些类型真菌的检测敏感度高于传统方法，例如曲霉菌；④不需要假设，可覆盖罕见真菌和其他类型病原体；⑤通过核酸序列进行物种鉴定，特异性高；⑥可检测真菌的耐药基因。

①对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位，在深部真菌感染中可能存在困难；②真菌细胞壁厚（例如曲霉菌），或有坚固荚膜（例如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性；③湿实验流程（例如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸的污染（例如灰绿霉菌），造成假阳性；④真菌基因组数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。

注意事项

（1）呼吸道感染mNGS检测的采集标本优选BALF（反映呼吸道感染最常用与较可靠的标本），备选痰液、气道吸引分泌物（容易受上呼吸道菌群污染）或胸腔积液、血液及肺穿刺组织（敏感性低，但结果可靠）。尽可能贴近病灶部位取样，同时避免样本污染。

（2）对破壁方案进行充分验证，在提升真菌破壁的同时不能显著降低易破壁微生物的检出率。采用技术手段监控样本中的人源背景，如人源背景过高需要进行去宿主处理，或增加测序数据量。

（3）如果检验报告结果为阴性，临床高度怀疑有真菌感染，要向检测部门索要原始结果。

（4）对于疑难病例、特殊病例及危重病例，必要时进行重复检测。

报告解读

mNGS可报告微生物类型如图1 。

 图1 

阳性结果判读

①若患者mNGS结果阳性且符合其临床表现和其他实验室检查，则推荐根据mNGS结果指导临床决策；②若患者mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏除mNGS结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证（在具有合适引物的条件下），并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证；③若患者mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。

阴性结果判读

若mNGS结果阴性：①真阴性，排除感染；②假阴性，根据其他辅助检查结果（例如培养结果等）高度提示感染可能，建议再次重复mNGS检测。

对于mNGS检测真菌阳性结果，临床暂时拿不到其他病原学的可靠结果，又不能除外感染的可能性，需要结合患者临床特征、当地流行病学情况、常规实验室检查结果，可以参照mNGS检测结果，及时进行经验性治疗，协助指导抗菌药物的选择，并密切观察治疗反应，跟踪随访，以验证结果的可靠性。

施毅教授最后对mNGS提出了一些未来的展望。mNGS检测出条件致病真菌（例如耶氏肺孢子菌、曲霉）后，目前还不能较好地协助临床判断定植或是感染，是否可以对不同标本不同病原体提出评估阈值或是将mNGS从定性提升到定量、精准的技术阶段；针对局灶真菌感染、深部真菌感染，是否可以进一步发挥血浆mNGS在真菌感染诊断中的价值；如果将鸟枪法mNGS与靶向检测结合，可否进一步提高特定真菌的检出率。这些都是需要继续努力的方向。施毅教授表示，在真菌病原学诊断中，mNGS还任重而道远！

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