TIPE2 在类风湿性关节炎患者中的表达及其对 NF-κB 信号通路的影响

石改绍，武新峰，王 飞，史晓飞（河南科技大学第一附属医院 风湿免疫科，河南 洛阳 471003）

摘要：

目的 检测类风湿性关节炎患者中 TIPE2 表达的变化，并探讨其相关的临床意义。

方法 收集 2010 年 10 月 ~2012 年 12 月该院风湿免疫科收治的类风湿关节炎病例 88 例，分为中高活动期 50 例，低活动 38 例，另取该院体检中心健康体检者 80 例作为正常对照组。TIPE2 mRNA 表达使用荧光定量 PCR 检测，C 反应蛋白（CRP）使用乳胶增强免疫比浊法检测，抗链球菌 O（ASO）使用快速乳胶凝集试验检测，类风湿因子（RF）和 P65 使用 ELISA 法。结果 对照组和类风湿关节炎患者 NF-κB 信号通路中 P65 蛋白的表达分别为（1.54± 0.41）和（3.44±1.02）μg/mL，各组之间差异具有显著性（P<0.05），类风湿关节炎患者外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 的表达水平为（0.24±0.08）显著低于对照组的（0.43±0.12）（P <0.05）。类风湿关节炎高活动期和低活动期患者在年龄、性别等临床资料方面差异无显著性（P >0.05），中高活动期患者 DAS 评分显著高于低活动患者（P <0.01）。非急性期患者 TIPE2 表达水平为（0.34±0.11）显著高于急性期患者的（0.16±0.06）（P <0.05），而 CRP、RF、ASO 的低活动组均显著低于中高活动期组（P <0.01）。结论 TIPE2 的低表达参与了类风湿关节炎病变的发生、发展，TIPE2 表达下调激活了 NF-κB 信号通路可能是其致病的主要机制。

关键词：类风湿关节炎；TIPE2；NF-κB 信号通路中图分类号：R593.22 

文献标识码：A The expression of TIPE2 in patients with rheumatoid arthritis and its effect to NF-κB pathway SHI Gai-shao, WU Xin-feng, WANG Fei, SHI Xiao-fei (The Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, P.R.China) Abstract:

【Objective】To investigate the expression of TIPE2 in patients with rheumatoid arthritis (RA) and its clinical significance.

【Methods】A total of 88 cases of RA patients were enrolled in this study. RA patients were di－ vided into two groups: medium and high activity group (n =50) and low activity group (n =38). Another 80 healthy person were used as a normal control. The mRNA levels of TIPE2 weremeasured by Real-time PCR analysis. The levels of serum C-reactive protein (CRP) were measured by Latex enhanced immunoturbidimetric analysis. Rapid la－ tex agglutination test was used to detect anti-streptococcus O (ASO) expression. The serum rheumatoid factor (RF) and P65 were measured by ELISA analysis.

【Results】The P65 protein of NF-κB signaling pathway was (1.54±0.41) and (3.44±1.02) μg/mL in control group and RA patients group. There was significant difference between the two groups (P <0.05). The mRNA expression of TIPE2 in AF patients was (0.24 ± 0.08), and which was significantly low－ er than (0.43 ± 0.12) of the control group (P <0.05). There was no significant difference of age and gender between the medium and high activity group and low activity group (P >0.05). The DAS scores were higher in medium and high activity group than that in low activity group (P <0.01). The mRNA expression of TIPE2 in low activity group was (0.34±0.11), and which was significantly higher than that of (0.16±0.06) in medium and high activity (P <0.05). The expression of CRP, RF, and ASO in low activity group was lower than that of in medium and high activity (P <0.05). 

【Conclusion】The low-level expression of TIPE2 involved in occurrence and development of rheumatoid arthritis disease. NF-κB signaling pathway was activated by downregulated TIPE2, which may be the main mecha－ nism of pathogenicity. Key words: rheumatoid arthritis (RA); TIPE2; NF-κB signaling pathway

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性破坏性关节炎为特征的全身性自身免疫病，其特点是关节滑膜的慢性炎症导致软骨吸收、骨质破坏和骨纤维化，2 年内即可发生不可逆性的关节损害，具有高致残性的特点，严重影响了患者的生活质量[1] 。类风湿性关节炎世界人群患病率为 0.18% ~1.07%，我国约有 500 万患者，目前类风湿性关节炎的发病机制尚未明了，故此临床上的药物只能对症治疗，多不能彻底治愈疾病。因此，研究类风湿性关节炎的发病机制，寻找新的有效的治疗靶点，仍然是临床工作者们迫切需要解决的难题[2] 。TIPE2（tumor necrosis factor-α induced protein 8-like 2）属于肿瘤坏死因子 α 诱导的蛋白 8 家族的一员，是一个新发现的免疫负调控因子，其在维持机体免疫稳态中发挥着重要的调节作用[3] ，已有研究显示其在多种人类自身免疫性疾病中出现表达异常[4] ，本研究检测了类风湿性关节炎患者中 TIPE2 表达的变化，并探讨了其相关的临床意义。 1 材料与方法 1.1 临床病例资料收集 2010 年 10 月 ~2012 年 12 月河南科技大学一附院风湿免疫科收治的类风湿关节炎病例 88 例。其中，男 44 例，女 44 例，年龄 44~72 岁，平均（61.6±7.8）岁，所有病例均符合 1987 年美国风湿病协会（ACR）修订的类风湿关节炎诊断标准[5] ，其中类风湿关节炎患者分为中高活动期（DAS28 大于 3.2） 50 例，低活动期（DAS28 小于 3.2）38 例。取我院体检中心 80 例年龄及性别匹配的健康体检者作为正常对照。排除标准：患有严重肝、肾、肺、脑等重要脏器功能不全；恶性肿瘤；妊娠；急慢性炎症疾病；原发性肾炎、狼疮等其他免疫炎症性疾病，1 个月内未服用免疫抑制剂等药物。 1.2 试剂和仪器 Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；dNTPMix、 RNasin 购自 TaKaRa 公司；M-MLV 逆转录酶及缓冲系统购自美国 Promega 公司；TaqDNA 聚合酶及缓冲系统购自 Biostar 公司；Oligo （dT）18 引物购自上海生工生物科技有限公司；TIPE2mRNA 引物由上海生工合成。淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品；C 反应蛋白（CRP）检测试剂盒由日本积水公司提供；类风湿因子（RF）检测试剂盒由西门子公司提供；抗链球菌 O（ASO）检测试剂盒值购自北京中杉金桥生物技术有限公司；P65 检测试剂盒购自长沙颐康科技开发有限公司。荧光定量 PCR 仪为美国 PE（ABI7000）公司产品，全自动生化分析仪为日本日立（HICTHI-7080）公司产品。 1.3 外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 表达的荧光定量 PCR（Real time-PCR）检测采集受试者外周血 5 mL，血细胞分离液分离单核细胞，1 mL Trizol 裂解组织，按照试剂说明提取细胞总 RNA，Oligo（dT）18 引物和 M-MLV 逆转录酶反转录出 cDNA 第一条链，cDNA 模板、TaqDNA 聚合酶、TIPE2 mRNA 引物和 SYBR Green 荧光染料定量检测 TIPE2 mRNA 的表达量。TIPE2 基因引物序列为 5'-GTCGGTTCGGTAGCGCTGCT-3' （sence）和 5'-TATCCTGGAACGTACGTATG-3' （antisence），内参照使用 GAPDH 基因。反应条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，6℃ 30 s，72℃ 30 s 35 个循环；72℃ 5 min。 △Ct 值 =TIPE2 的 Ct 值 - 内参的 Ct 值，TIPE2 基因的表达量使用 2-△Ct 评估。 1.4 外周血 CRP、RF、ASO 的检测采集外周静脉血 5 mL，1 500 g 离心 15 min 分离血清，-70℃低温保存待测。CRP 使用乳胶增强免疫比浊法检测，RF 使用 ELISA 法检测，ASO 使用快速乳胶凝集试验检测，所有操作严格按着试剂盒说明书进行，使用日立 HICTHI-7080 全自动生化分析仪检测，根据标准品计算出相应因子的表达水平，均使用质控品进行定期校准和每日批问质控。 1.5 外周血单核细胞 NF-κB 信号通路活性的检测采集受试者外周血 5 mL，血细胞分离液分离单核细胞，细胞裂解液裂解细胞，3 000 g 离心 10 min，取上清，使用 ELISA 检测 NF-κB 信号通路中 P65 表达的变化，严格按试剂盒说明操作，日立 HICTHI-7080 全自动生化分析仪测定吸光度的变化，根据标准品计算样品中 P65 的表达水平。 1.6 统计分析应用 SPSS 12.0 软件进行统计学处理。实验数据以（x±s）表示，两样本间均数比较采用 t 检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，Pearson 相关性分析分析各检测指标的相关关系，P <0.05 为差异有显著性。 2 结果 2.1 类风湿关节炎患者外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 表达水平的变化对照组和类风湿关节炎患者 NF-κB 信号通路中 P65 蛋白的表达分别为（1.54±0.41）和（3.44± 1.02）μg/mL，各组之间差异具有显著性（P <0.05），类风湿关节炎患者外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 的表达水平为 （0.24±0.08） 显著低于对照组的（0.43±0.12）（P <0.05）。见表 1。 2.2 类风湿关节炎患者外周血单核细胞 TIPE2 表达与 CRP、RF、ASO 的相关性分析类风湿关节炎高活动期和低活动期患者在年龄、性别等临床资料方面差异无显著性（P >0.05），中高活动期患者 DAS 评分显著高于低活动患者（P <0.01）。类风湿关节炎低活动患者外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 的表达水平为 0.34±0.11 显著高于中高活动期患者的 （0.16±0.06）（P <0.05），而 CRP、 RF、ASO 的低活动组均显著低于中高活动期组（P <0.01）。见表 2。

3 讨论类风湿关节炎的病变特点为滑膜炎，由此造成侵蚀性的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形，机体免疫稳态的紊乱导致的体内高炎性状态是其病变的主要机制[6] ，TIPE2 基因是近来新发现的一个免疫负调控因子，主要表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫应答组织中，实验研究显示 TIPE2 基因敲除小鼠会发生多器官自发性炎症以及 IL-1、IL-2、IL-12 和 TNF-α 等炎性因子表达水平的升高[7] ，184 个氨基酸残基构成的 TIPE2 蛋白中央有一个巨大的疏水性腔体结构，这个疏水腔用于结合配体，当配体被释放后可以负性调节机体的固有免疫反应和适应性免疫反应[8] 。本研究的结果显示类风湿关节炎患者外周血单核细胞 TIPE2 mRNA 的表达水平显著低于健康对照组，提示了 TIPE2 表达的失活可能参与了类风湿性关节炎的致病，进一步的研究显示类风湿关节炎低活动期患者 TIPE2 表达显著高于中高活动期患者，并且相关性分析也显示了 TIPE2 表达与 CRP、RF 及 ASO 类风湿检测因子呈显著负相关，上述结果提示了 TIPE2 表达的失活可能参与了类风湿性关节炎病变的进展。 NF-κB 信号通路是类风湿关节炎滑膜炎性反应发生、发展的一条重要炎性细胞信号转导途径[9] ， NF-κB 的活性主要通过释放 P65、P50 蛋白进入细胞核，发挥转录因子活性，调节炎性因子例如肿瘤坏死因子、白细胞介素 -1 的表达，发挥致炎作用，所以检测 P65 蛋白的含量就可以间接反映出 NF-κB 的活化程度[10]。本研究显示了是类风湿关节炎患者 P65 表达显著高于健康对照，说明了 NF-κB 信号通路的激活，相关性分析又显示了 TIPE2 与 P65 表达呈显著负相关，已有实验研究显示 TIPE2 与 Caspase-8 结合后会抑制 NF-κB 的活化[11]，上述结果提示了 TIPE2 低表达导致的类风湿关节炎患者高炎症反应状态是通过激活了 NF-κB 通路来实现的。总之，本研究显示了类风湿关节炎患者中存在 TIPE2 的低表达，TIPE2 表达的下调激活了 NF-κB 通路可能是其参与类风湿关节炎病变发生、发展的主要作用机制。

参 考 文 献： 

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