本文作者：徐沁 福建省肿瘤医院

【摘要】目的 检测细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（EMMPRIN）在宫颈癌中的表达及与金属蛋白酶-2（MMP-2），金属蛋白酶-9（MMP-9）的关系，以探讨EMMPRIN在宫颈癌浸润转移中的作用。方法　应用免疫组化的方法检测110例早中期宫颈癌标本中EMMPRIN、MMP-2及MMP-9的表达，用卡方检验和相关分析了解其与临床病理参数的关系。结果 EMMPRIN、MMP-2及MMP-9表达于宫颈癌组织中。EMMPRIN、MMP-2及MMP-9在宫颈癌中的表达分别为70.9％（78例）、62.7％（69例）及52.7％（58例）。EMMPRIN的阳性表达分别和世界妇产科联盟（FIGO）分期（P＝0.001），病理学类型（P＜0.001）、分化程度相关（P＜0.001），呈现显著性相关；但与年龄、肿瘤大小、宫旁浸润、淋巴结转移、肿瘤复发以及生存率无显著性相关。EMMPRIN在宫颈癌中分布表达和MMP-2（P＜0.001，相关系数R＝0.583）及MMP-9（P＜0.001，相关系数R＝0.556）呈现正相关性。结论　宫颈癌EMMPRIN的表达和MMP-2及MMP-9呈相关性，提示EMMPRIN在肿瘤的局部转移浸润及预后的相关性中起着举足轻重的作用。

宫颈癌为世界妇科恶性肿瘤中第二高发病率肿瘤，大约占妇女肿瘤的16％^［1］，而宫颈癌发病率占我国妇科恶性肿瘤之首。众所周知，细胞外基质的重建在肿瘤细胞的局部浸润和转移中起着举足轻重的作用。EMMPRIN及其下属金属蛋白酶MMP-2和MMP-9在宫颈癌中的表达及意义尚未得到详尽的阐述。本研究应用免疫组化的方法对较大样本的宫颈癌中细胞外基质因子进行研究，报告如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料：待检标本110例，均为2005～2007年本院手术切除的宫颈癌肿瘤库存标本蜡块。所有手术患者均未预先接受过术前放化疗。患者的临床分期严格参照2005年世界妇产科联盟（F1-GO）分期。所有的病理标本均由2名独立的高年资病理科医师作出诊断。

1.2　方法：EMMPRIN、MMP-2及MMP-9表达的检测，全部石蜡标本均切成5μM厚的组织切片，用于免疫组化染色。常规脱蜡，阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗，加入特异性第一抗体，37℃恒温1小时，添加特异性第二抗体，镜下观察显色反应，固定封片。双盲阅片，于10×20倍显微镜下，随机观察10个视野，按显色强度和阳性细胞数所占比例分级，阳性标记物呈棕黄色颗粒。EMMPRIN、MMP-2及MMP-9在肿瘤细胞中表达程度，均分为-、＋、＋＋、＋＋＋4级。阴性（-）：细胞不着色或色同背景；弱阳性（＋）：细胞显色较背景组织强，阳性细胞数＜10％；中度阳性（＋＋）：介于弱阳性与强阳性之间；强阳性（＋＋＋）：细胞内有较多粗大的棕色颗粒，阳性细胞数＞50％。

1.3　统计学处理：MMP-2、MMP-9及EMM-PRIN均采用SPSS 16软件中的卡方检验和相关系数检验。以P＜0.05及P＜0.01表示。

2　结果

2.1　EMMPRIN与MMP-2及MMP-9的关系：110例宫颈癌组织均检测EMMPRIN、MMP-2及MMP-9的表达。86例患者标本为鳞状细胞癌，10例为腺癌，4例为小细胞癌，10例为腺鳞癌。MMP-2及MMP-9主要存在于细胞膜，EMMPRIN主要存在于细胞浆及细胞膜上（图1a、b、c）。三种的细胞因子均明显表达于各型宫颈癌中，其中EMMPRIN　78例（70.9％），MMP-2　69例（62.7％）及MMP-9　58例（见表1）。26例（23.6％）MMP-2、EMMPRIN同时表现为阴性或弱阳性；63例（57.3％）MMP-2、EMMPRIN同时表现为阳性或强阳性。另一方面，29例（26.4％）MMP-9、EMMPRIN表示为阴性或弱阳性；55例（50％）MMP-9，EMMPRIN同时表示为阳性或强阳性。

2.2　EMMPRIN与年龄、FIGO分期、组织学、淋巴结转移、分化程度、肿瘤大小及宫旁浸润情况的关系：EMMPRIN和诸多临床相关因素的关系。EMMPRIN的表达和肿瘤FIGO分期（P＝0.001）、病理类型（P＜0.001）及分化程度（P＜0.001）呈正相关性；另一方面，EMMPRIN的表达和患者年龄（≤45岁，＞45岁）（P＝0.516）、淋巴结转移（P＝0.505）、肿瘤大小（≤4cm、＞4cm）（P＝0.827）及宫旁浸润（P＝0.035）无显著性相关。

2.3　EMMPRIN与3年生存率及复发的关系：5.1％（78例中的4例）的3年后死亡患者中EMMPRIN表现为强表达，相反0％（32例中的0例）表现为EMMPRIN的弱阳性或阴性，然而这种差别并无统计学意义（P＝0.457）。另外，在复发的患者中有12例表现为EMMPRIN阳性，而66例的未复发患者中也同时表示为EMMPRIN的阳性表达，两组之间差异无统计学意义（P＝0.665）。

3　讨论

EMMPRIN是一种高度表达于肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白。Yu等^［2］研究表明，EMMPRIN高度表达于14个脏器来源的28种恶性肿瘤以及造血系统。EMMPRIN主要诱发细胞外基质中的MMP，MMP-1、2、3、9、14、15通过自分泌的形式激活肿瘤细胞外基质的纤维组织，从而促进肿瘤的局部转移及扩散^［3-4］。本研究通过免疫组化的方法在110例宫颈癌组织标本中发现EMMPRIN高度表达。EMMPRIN的表达和FIGO分期、病理类型及分化程度呈现正相关性。EMMPEIN在FIGO IB1期以上的宫颈癌患者中有显著性表达（P＜0.001）。在组织学方面，小细胞癌及腺鳞癌中的EMMPRIN表达明显高于腺癌鳞癌（P＜0.000），中-低分化肿瘤中EMMPRIN的表达明显高于高分化肿瘤（P＜0.000）。

上述结果可以解释临床上分期较晚、病理类型较差、分化程度幼稚的患者往往表现为易复发、对放化疗不敏感、预后偏差等特性。EMMPRIN的表达与MMP-2及MMP-9呈现正相关性，表明在宫颈癌细胞中，EMMPRIN可能是通过激活MMP-2及MMP-9途径通路从而激活细胞外基质破坏重建，使肿瘤发生扩散转移。WaNG等^［5］报道MMP-2MRNA及蛋白水平高度表达64例宫颈癌组织中，然而与肿瘤复发和生存率之间无显著相关性。另一方面，Yu等^［6］研究表明在65例的宫颈鳞状细胞癌组织中MMP-9及EMMPRIN的表达和肿瘤的浸润、转移及不良预后的差异有统计学意义，但MMP-9MRNA水平和FIGO分期差异无统计学意义。虽然以上结果是与本研究不同，但本文为大样本研究，涵盖了鳞癌、腺癌、小细胞癌及腺鳞癌等多种细胞类型，更具有统计学意义。

综上所述，本研究综合EMMPRIN、MMP-2及MMP-9在较大样本量宫颈癌组织中的表达及其相关性，初步了解EMMPRIN及其细胞外基质系统在宫颈癌局部浸润转移中的作用，可作为评估宫颈癌预后的一种生物学指标。

联合应用TTF-1、napsinA和SP-A在穿刺活检标本中肺源性腺癌和非肺源性腺癌的诊断意义

本文作者：胡丹 福建省肿瘤医院

【摘要】

目的 检测TTF-1、napsin A和SP-A在穿刺活检标本中肺源性腺癌及非肺源性腺癌的表达，探讨联合应用这3个抗体对判断转移性肺腺癌的意义。方法 采用免疫组化En Vision法检测207例穿刺及气管镜活检肿瘤组织(其中原发性肺腺癌83例、转移性肺腺癌79例，非肺来源转移性腺癌45例)中TTF-1、napsin A和SP-A的表达。结果 TTF-1在原发性肺腺癌、转移性肺腺癌和非肺来源的转移性腺癌中表达率分别为88%(73/83)、78.5%(62/79)、28.9%(13/45);napsin A的表达率分别为79.5%(66/83)、75.9%(60/79)、11.1%(5/45);SP-A的表达率分别68.7%(57/83)、59.5%(47/79)，4.4%(2/45)，三者在原发性肺腺癌、转移性肺腺癌和非肺来源的转移性腺癌表达之间差异显著(P＜0.05)。TTF-1、napsin A和SP-A在肺腺癌表达的特异性分别为71.1%、88.9%和95.6%。结论 TTF-1、napsin A和SP-A联合应用对判断转移性肺腺癌有重要意义。

肺癌是全球导致死亡最主要的恶性肿瘤之一，肺腺癌是最常见的肺癌病理组织学类型，占肺癌35%～50%^［1］。多数肺癌患者确诊时已为晚期，无法行手术切除，此时肿瘤治疗的关键是正确诊断原发病灶来源和准确分期，选择最适合的放化疗方案，阻断和控制转移病灶。对转移灶进行穿刺活检具有创伤小、方便快捷的优点，组织学检查可发现肿瘤转移的信息。由于大部分来源不同的转移性腺癌形态学相似，明确原发灶比较困难，而不同来源的腺癌在临床治疗及预后上有较大差异，因此寻找转移性腺癌原发灶显得尤为重要。近年来随着免疫组化技术的发展和大量有价值抗体的出现，为明确转移性肿瘤的性质和来源提供了极大的帮助。本文应用免疫组化检测TTF-1、napsinA和SP-A在穿刺及气管镜活检标本中肺源性腺癌及非肺源性腺癌的表达，探讨其对判断转移性肺腺癌的意义。

1 材料与方法

1.1 材料  回顾性收集福建省肿瘤医院2010—2013年穿刺及气管镜活检标本共207例，男性128例，女性79例，年龄38～79岁，平均年龄58.4岁。其中83例经支气管镜或经皮肺穿刺确诊原发性肺腺癌，79例转移性肺腺癌(穿刺或活检部位:皮肤7例、淋巴结54例、纵隔及胸膜2例、骨4例、肾1例、脑5例、肝3例、肠2例、肾上腺1例)及45例非肺来源转移性腺癌(穿刺或活检部位:皮肤4例、淋巴结31例、肺4例、肝2例、脑1例、骨3例);明确原发灶来源肠癌6例，甲状腺乳头状癌7例，肝癌3例，卵巢癌5例，胃癌7例，子宫内膜癌4例，乳腺浸润性导管癌9例，腮腺黏液表皮样癌1例，前列腺癌3例。所有患者穿刺活检前均未行放化疗。

1.2 方法  所有标本均经4%中性甲醛固定、石蜡包埋、常规切片及HE染色。免疫组化试剂TTF-1、napsinA和SP-A均购自福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组化检测采用EnVision二步法，操作严格按照试剂说明书进行，用正常肺组织切片作阳性对照，PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。

1.3 结果  判定TTF-1阳性染色为棕黄色或棕褐色，定位于细胞核。napsinA和SP-A阳性染色为棕黄色或棕褐色，定位于细胞质。按上皮细胞显色比例及染色强度进行评分，每一标本选取5个400倍视野统计阳性细胞数，阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。按细胞显色强度计分:未显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。2项分值相乘，取5个视野平均分为该标本得分。按得分表达情况分为4个等级:0～1分(-)，2～4分为(+)，5～8分为(++)，＞9分为(+++)。

1.4 统计学分析  所有数据均采用SPSS13.0软件进行分析，各组的表达差异用χ²检验。

2 结果

2.1 镜检  83例原发性肺腺癌生长方式包括贴壁为主型、腺泡状、乳头状、微乳头状和实性型，124例转移性腺癌组织学形态显示分化好的癌细胞呈腺样排列，分化差者呈单行簇状排列伴细胞内黏液。

2.2 免疫组化  TTF-1、napsinA和SP-A在原发性肺腺癌、转移性肺腺癌和非肺来源的转移性腺癌中表达情况。三者在原发性肺腺癌、转移性肺腺癌和非肺来源的转移性腺癌表达之间差异显著(P＜0.05)。非肺来源的转移性腺癌中TTF-1共13例(+)(2例肠癌、7例甲状腺癌、1例肝内胆管细胞癌、1例胃癌、1例卵巢癌、1例乳腺癌);napsinA共5例(+)(1例肠癌、1例甲状腺癌、2例胃癌，1例子宫内膜癌);SP-A共2例(+)(1例甲状腺癌、1例子宫内膜癌)。TTF-1、napsinA和SP-A在肺腺癌表达的特异性分别为71.1%(32/45)、88.9%(40/45)和95.6%(43/45)。

3 讨论

目前许多恶性肿瘤尤其是肺癌患者确诊时已为晚期，有些甚至以转移灶为首发症状，所以明确不同来源的转移癌在临床治疗及预后尤为重要。本文应用免疫组化检测TTF-1、napsinA和SP-A在穿刺及气管镜活检标本中转移性腺癌的表达，探讨联合应用这3个抗体对判断转移性肺腺癌的意义。TTF-1是大家所熟知的一项抗体，它是分子量为38～40 KDa的核蛋白，在胎儿肺组织和成人Ⅱ型肺泡上皮中存在，在成人组织中主要分布在内胚层分化的甲状腺滤泡上皮、间脑局部和呼吸道上皮，是目前最常用的诊断肺腺癌的标记物。但TTF-1除了在肺腺癌中高表达外，在其他肿瘤中表达也较高如甲状腺癌、小细胞癌、卵巢癌和鳞状细胞癌等^［2］。

本研究统计结果显示在原发性肺腺癌和转移性肺腺癌中表达率分别为88%和78.5%，而在非肺来源的转移性腺癌表达28.9%。TTF-1阳性的13例非肺来源的转移性腺癌分别为2例肠癌、7例甲状腺癌、1例肝内胆管细胞癌、1例胃癌、1例卵巢癌、1例乳腺癌，其中7例转移性甲状腺癌均呈强阳性，与国外文献报道相似^［3］。研究表明TTF-1虽然是判断肺腺癌的一项敏感指标，但其特异性并不高，仅凭这一项指标难以明确转移性腺癌来源于肺，尤其是对于鉴别转移性肺腺癌及甲状腺癌。napsinA是一种分子量接近38 KDa的单链蛋白，表达在肺Ⅱ型上皮。

Turner等^［4］研究了967例原发性肺腺癌和转移性腺癌(包括膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胆管癌、肠癌、卵巢癌、子宫癌和胃癌)，发现＜5%的转移性癌表达napsinA，在原发性肺腺癌中87.1%表达napsinA，64%表达TTF-1，26.6%napsinA阳性而TTF-1阴性，作者认为napsinA对于鉴别肺腺癌是一项非常有参考价值的指标，其特异性高于TTF-1。本文研究结果显示

napsinA在原发性肺腺癌和转移性肺腺癌中表达率为79.5%和75.9%，在非肺来源的转移性腺癌中表达率为6.7%，仅在1例肠癌、1例甲状腺癌、2例胃癌，1例子宫内膜癌中呈弱～中阳性。比较TTF-1在肺腺癌的表达，napsinA的敏感性略低于TTF-1，但其特异性略高于TTF-1。国外较多文献比较TTF-1和napsinA在肺腺癌中的表达，Stoll等^［5］研究了75例肺腺癌和95例对照组中napsinA和TTF-1的表达，发现TTF-1的敏感性和特异性均为81%，而napsinA的敏感性为65%，特异性为96%，与本文研究结果相似，且Stoll还发现napsinA在小细胞癌及其他器官来源的转移癌(除肾细胞癌外)均无表达，因此认为在低分化肺腺癌或原发灶不明的情况下，特别是细胞学和穿刺活检标本中，napsinA和TTF-1双重标记，可以提高诊断的准确性。Jagirdar^［6］发现因napsinA常在肾细胞癌中存在假阳性，因为其在阴性对照组中也阳性表达，其原因可能因为肾脏上皮中含内源性生物素。SP-A又称表面活性蛋白A，位于肺Ⅱ肺泡上皮中，在维持肺泡表面张力起重要作用Saitoh等^［7］用RT-PCR分析42例胸腔积液患者中SP-1基因转录水平，发现在7例原发性肺腺癌SP-A基因的转录水平明显高于其他转移性癌。Nicholson^［8］用免疫组化方法检测107例原发性肺癌中SP-A的表达，其中包括40例肺腺癌和26例肺转移性腺癌，研究发现所有非黏液性原发性肺腺癌及细支气管肺泡癌呈阳性，而10%大细胞未分化癌、20%小细胞及40%非典型类癌呈局灶阳性，肺鳞状细胞癌和其他26例转移性癌如乳腺癌、肾癌、大肠癌、卵巢癌均阴性。本文研究结果显示SP-A在原发性肺腺癌和转移性肺腺癌阳性率为68.7%和59.5%，其敏感性均低于TTF-1和napsinA。但SP-A在45例非肺来源转移性腺癌中仅2例表达，包括1例甲状腺癌、1例子宫内膜癌，特异性达95.6%，与Nicholson的研究结果相似，因此SP-A是诊断原发性肺腺癌的一项高度特异性和中度敏感性的指标。Zamecnilc等^［9］用免疫化方法检测109例原发性肺癌和肺转移性癌中TTF-1和SP-A，发现TTF-1和SP-A在原发性肺腺癌中的表达分别为75%和50%，而肺小细胞癌TTF-1表达为89%，SP-A无表达，且SP-A在肺鳞状细胞癌和类癌中也为阴性。在肺外肿瘤组中，TTF-1在11例甲状腺癌中8例阳性，而SP-A均呈阴性。因此Zamecnilc认为在判断肺原发性腺癌时，联合应用SP-A和TTF-A比单独应用TTF-1更具诊断价值。

本文首次联合运用TTF-1、napsinA和SP-A检测穿刺活检标本中在原发性肺腺癌及转移性腺癌中的表达，结果显示TTF-1、napsinA和SP-A在原发性肺腺癌中表达率分别为88%、79.5%和68.7%，而在转移性肺腺癌中表达率均略有下降分别为78.5%、75.9%和59.5%。推测原因其一可能是穿刺标本所含肿瘤组织少，具有一定的局限性;其二可能是肿瘤细胞在转移过程中存在异质性和可变性，在肿瘤的进展或转移中蛋白通路可能被关闭^［10］。

比较穿刺活检标本中转移性肺腺癌和非肺来源的转移性腺癌TTF-1、napsinA和SP-A的表达，发现对于诊断转移性肺腺癌TTF-1的敏感性最高而特异性最低，SP-A的敏感性最低而特异性最高，napsinA具有中度以上的敏感性和特异性，因此联合应用TTF-1、napsinA和SP-A可提高诊断准确度，比单独应用其中任何一项指标更具价值。

总之，组织学形态和免疫组化对判断转移灶来源具有重要意义，TTF-1、napsinA和SP-A三种抗体联合应用可使绝大部分转移性肺腺癌得到明确诊断，但迄今为止，并无一种免疫标记是绝对特异的，因此在诊断工作中仍要注意结合临床其他检查结果和HE切片观察，才能得到正确的诊断结论。