陈杏玲1 郭婷婷2 麦靖怡3 粟之花2 章 俊2

DOI：10.3969/j.issn.1006-298X.2025.05.006

[基金项目] 广东省自然科学基金面上项目(2021A1515012175;2024A1515010402)

[作者单位] 1惠州市第一人民医院肾内科(惠州,516000);2南方医科大学第二临床医学院珠江医院肾内科;3 广州医科大学附属番禺中心医院肾内科

[通信作者] 章 俊(E-mail:gzh_zj@qq.com)

摘 要 目的:探讨难治性腹膜透析相关性腹膜炎(PDAP)的肠道菌群特征,为其作为靶点防治难治性PDAP提供初步证据。 方法:收集2021年1月至10月南方医科大学珠江医院肾内科腹膜透析(PD)患者的粪便标本,分为难治性PDAP组(24例)和普通PD组(20例),通过16srDNA测序方法得出两组间物种多样性及组成差异;初步探讨难治性PDAP肠道菌群特点。 结果:难治性PDAP组的肠道菌群组成主要包括厚壁菌门(32.5%)、拟杆菌门(27.8%)、变形菌门(23.2%)、放线菌门(13.2%)等;两组的α多样性无显著差异(P>0.05),β多样性有显著差异(P=0.008);相较于PD组,难治性PDAP患者的肠道菌群组成发生改变,棒状杆菌属、肠球菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属等致病菌属较多,而普氏菌属、小杆菌属、消化球菌属、魏斯氏菌属等产生短链脂肪酸的有益菌属较少。 结论:难治性PDAP患者的肠道菌群组成发生改变,其致病菌属较多,而产生短链脂肪酸的有益菌属较少。

关键词  腹膜透析相关性腹膜炎  肠道菌群

Characteristics of intestinal flora in patients with refractory peritoneal dialysis associated peritonitis

CHEN Xingling1, GUO Tingting2, MAI Jingyi3, SU Zhihua2, ZHANG Jun2

1Departmentof Nephrology, Huizhou FirstHospital, Huizhou516000, China 

2Department of Nephrology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510000, China

3The Affiliated Panyu Central Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, China

Corresponding author：ZHANG Jun(E-mail:gzh_zj@qq.com)

ABSTRACT Objective:To investigate the characteristics of the gut microbiota in refractory peritoneal dialysis-as sociated peritonitis (PDAP) and to provide preliminary evidence for targeting the gut microbiota in the prevention and treatment of refractory PDAP. Methodology:Fecal specimens were collected from peritoneal dialysis (PD) patients in the Department of Nephrology, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, between January and October 2021.Participants were divided into a refractory PDAP group (n=24) and a control PD group (n=20). 16S rDNA sequencing was employed to analyze differences in species diversity and composition between the two groups, aiming to preliminarily characterize the gut microbiota in refractory PDAP. Results:The flora composition of refractory PDAP group at the phylum level mainly included Firmicutes (32.5%), Bacteroidetes (27.8%), Proteobacteria (23.2%) and Actinobacteria (13.2%). No significant differences were showed in α diversity of intestinal flora between PD and refractory PDAP groups (P>0.05). But there were significant differences in β diversity (P=0.008). Refractory PDAP group had more uremic toxin producing gut microbiota, such as corynebacterium, enterococcus, pseudomonas and staphylococcus. Refractory PDAP group had fewer short-chain fatty acids producing gut microbiota, such as prevotella, dialister, peptococcus and weissella. Conclusion:Refractory PDAP group had more uremic toxin producing gut microbiota and fewer short-chain fatty acids producing gut microbiota.

Key words peritoneal dialysis associated peritonitis   intestinal flora

近年来,学界广泛认同肠道菌群可作为人体的一个重要内分泌器官,其对机体健康的多方面益处已得到深入研究,主要包括四个层面:(1)帮助身体消化食物和吸收营养;(2)保护肠道屏障,抵抗病原菌入侵;(3)改善肠道免疫系统的发育和功能;(4)调节宿主代谢[1]。然而,微生物群的组成会随着外界因素的变化出现动态变化,直接或间接导致某些疾病的发生或进展。

接受腹膜透析(PD)治疗患者最常见的并发症为腹膜透析相关性腹膜炎(PDAP),是导致患者停止PD治疗的重要原因。与非难治性PDAP相比,难治性PDAP对人体的损伤往往更严重且不可逆:(1)可能导致不可逆的超滤衰竭及腹膜纤维化,迫使患者永久退出PD,转为血液透析;(2)显著增加患者死亡风险,尤其是合并脓毒症及多器官功能衰竭者;(3)长期广谱抗生素应用可能进一步导致菌群失调,增加二重感染风险,大幅提升医疗成本。近期研究发现,发生感染的PD患者与普通PD患者相比,肠道中有益菌种占比下降,而致病菌种水平较高[2]。此外,Zhou等[3]也提出肠道微生物群紊乱与PDAP的发生有关。部分学者认为,肠道微生物组的失调可能是通过破坏肠道屏障、激发炎症和影响尿毒症毒素的代谢,从而导致PD患者感染风险增加[4]。本研究为横断面研究,旨在探讨单中心难治性PDAP患者肠道微生物的组成及多样性的改变。

对象和方法

研究对象 纳入于2021年1月至10月南方医科大学珠江医院肾内科住院的PDAP患者。纳入标准:(1)开始长期持续PD治疗的患者;(2)符合2022年ISPD指南关于难治性PDAP的确诊条件[5]:以合适的抗生素治疗5 d后,仍有持续性流出液混浊或持续性流出液白细胞计数>100×106/L。排除标准:(1)年龄不满18周岁;(2)在收集粪便标本30 d前,患者曾经使用过免疫抑制剂或者抗生素治疗;(3)合并溃疡性结肠炎、肠结核等其相关胃肠道疾病。对照组为同期普通PD患者:连续PD治疗3个月以上,观察期间临床情况稳定,且无腹膜炎病史。本研究通过南方医科大学珠江医院医学伦理审查(批准文号2020-KY-054-01)。

临床资料的收集 (1)基本信息:性别、年龄、透析龄、体质量指数(BMI)、肾脏原发病、伴随疾病(糖尿病)。(2)血液检查指标:患者在抗菌药物治疗之前,抽取清晨空腹静脉血送检全血细胞计数、电解质、肝肾功能、其他相关指标(甲状旁腺激素、铁蛋白)。

肠道菌群的标本收集与处理

标本的收集与保存 收集入组的普通PD患者及PDAP患者(抗菌药物治疗之前)的新鲜粪便,并于30 min内存放于-80℃的实验室冰箱内低温保存;随后统一送检。

DNA提取 使用CTAB技术和1%琼脂糖凝胶电泳对提取标本的基因组DNA并进行浓度以及纯度的检测。

PCR扩增 (1)模板:加入无菌水稀释后得到PCR扩增的模板。(2)引物:测序区域为标本DNA的V3+V4双区。(3)酶和缓冲液:使用高效以及高保真酶的酶来进行PCR扩增程序。(4)纯度检测:对得到的PCR产物进行电泳检测来评估纯度。

测序方法 本研究采用16SrDNA测序技术,并使用Illumina 公司生产的建库试剂盒;构建好的文库采用Qubit定量以及文库检测;测序过程使用NovaSeq 6000 PE250程序。

肠道菌群的多样性分析

α多样性分析 一般用来度量单个样本间物种多样性的程度,描述了每个物种所占样本的比例,主要评估样本内多样性程度。本研究选用Chao1指数和香农指数评估α多样性,指数越高,则表明样本的α多样性越高,物种组成越复杂。

β多样性分析 β多样性指数侧重于比较各个样本之间的微生物群落组成的差异性,一般是用来评估样本间的多样性。与α多样性相比较,β多样性着眼于比较两个群落或生态系统之间的物种多样性。

肠道菌群的物种差异分析 通过LEfSe分析方法得到两组间组成有差异的物种。LEfSe 方法基于相对丰度表,用于筛选相对于其他分组,在目标组中含量显著较高的差异微生物。使用LDA分数的大小来表示菌群间有差异的物种,通常LDA分数>2,就认为是两组间有意义的差异物种,这个数值越大,表示物种的差异越大。

统计学方法 采用《SPSS 26.0》统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,使用两独立样本t检验来进行两组间比较;不符合正态分布的计量资料采用中位数(四分位间距)来表示,采用非参数检验来进行两组间比较。用频数及百分比表示计数资料,使用χ2检验(皮尔森χ2检验、连续校正等)进行组间比较,选择Benjamini-Hochberg错误发现率方法对关于肠道菌群的假设检验进行矫正,P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

基本临床资料 难治性PDAP组患者24例,普通PD组患者20例,两组基本临床资料无统计学差异。

表1  两组PD患者的基本临床资料

PDAP:腹膜透析相关性腹膜炎;PD:腹膜透析

实验室检查结果 难治性PDAP组中白细胞计数、中性粒细胞计数、肾小球滤过率、铁蛋白等水平显著高于普通PD组(P<0.05),而血清肌酐、尿酸、血清白蛋白等水平偏低(P<0.05),其余实验室指标无统计学差异(表2)。

表2  两组PD患者实验室检查结果

PDAP:腹膜透析相关性腹膜炎;PD:腹膜透析;PTH:甲状旁腺激素

肠道菌群的基本组成分析 难治性PDAP组患者在门水平上的菌群构成中占比最高的为厚壁菌门(32.5%)和拟杆菌门(27.8%),其次为变形菌门(23.2%)和放线菌门(13.2%)等。普通PD组患者在门水平上的菌群构成中占比最高的为拟杆菌门(37.1%)和厚壁菌门(35.3%),其次为变形菌门(14.9%)和放线菌门(4.3%)等(图1)。

图1  两组PD患者在门水平上的相对分布情况

PDAP:腹膜透析相关性腹膜炎;PD:腹膜透析

肠道菌群的多样性比较

α多样性 普通PD组的香农指数高于难治性PDAP组,提示其物种多样性较高,但无统计学差异(P=0.27)。而PD组和难治性PDAP组Chao1指数亦无统计学差异(P=0.85)。由此说明两组的α多样性无统计学差异。

β多样性 通过对Bray Curtis距离进行假设检验,可以比较难治性PDAP组和对照组之间的微生物构成是否有显著性差异,检验方法为PERMANOVA,如图2所示,难治性PDAP组与PD组的Bray Curtis距离具有统计学意义(P=0.008),提示两组的β多样性具有差异,证明难治性PDAP组的肠道菌群组成发生了改变。

图2  β多样性的箱形图

PDAP:腹膜透析相关性腹膜炎;PD:腹膜透析;横向为分组信息,纵向为样品之间的距离,P<0.05可推断两组间菌群结构存在显著差异

肠道菌群的物种差异分析 图3难治性PDAP组与普通PD组中存在差异的物种较多,本研究选择在属水平中LDA分数>3.5的微生物进行描述。结果显示,难治性PDAP组的特征性菌群为棒状杆菌属、肠球菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、短波单胞菌属、乳酸杆菌属等。PD组的特征性菌群在为普氏菌属、梭杆菌属、弯曲杆菌属、小杆菌属、消化球菌属、魏斯氏菌属、粪芽孢菌属。

图3  普通PD组和难治性PDAP组的LEfSe分析结果

PD:腹膜透析;PDAP:腹膜透析相关性腹膜炎;属水平的LEfSe分析cladogram图,绿色代表难治性PDAP组的特征微生物,红色则代表PD组的特征微生物;cladogram图由内到外,分别对应界门纲目科属不同的分类层级,每个圆圈节点代表一个物种,黄色代表在分组间差异不显著,不为黄色则代表该物种是对应颜色分组的特征微生物(在该分组丰度显著较高)

讨 论

人类肠道微生物群由1 500多种物种构成,分布在50多个不同的门,其中拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门因其比例较高在人体肠道微生物群中占主导地位,其他如变形菌门、疣微菌门、梭杆菌门的比例则较少[6]。本研究的结果提示,难治性PDAP组、普通PD组与正常人群的肠道菌群组成存在差异,呈现出厚壁菌门和拟杆菌门占比的明显下降,而放线菌门和变形杆菌门的占比出现上升。这与Hu等[7]报道的PD肠道菌群组成改变的结果一致。同时,本研究还发现难治性PDAP组患者相较于普通PD组,上述改变会更加明显。尽管厚壁菌门与拟杆菌门是人类肠道占绝对优势的微生物群,但其比例在不同个体之间可能存在显著差异,对人类健康的影响尚不完全明确。Wong等[8]发现透析患者微生物生态失调表现为产生脲酶、尿酸酶、吲哚和对甲酚形成酶的菌群增加,而产生短链脂肪酸(SCFA)的菌群下降。SCFA是膳食纤维在结肠中发酵的主要产物,对人体有益,可增加钙和镁的吸收,减少潜在的病原菌,作为上皮细胞的能量来源并参与免疫调节。Zhang等[9]则进一步发现,高水平的血清三甲胺-N-氧化物(TMAO)与PDAP的发生显著相关,高水平的TMAO可触发炎性细胞的浸润和炎性细胞因子的产生,并诱导间皮细胞的坏死,将PD患者的微炎症状态加重至腹膜炎状态。TMAO主要来自饮食胆碱,卵磷脂和左旋肉碱,肠道微生物群将这些成分代谢为三甲胺,三甲胺被含黄素的单加氧酶进一步氧化生成TMAO[10]。肠道微生物的失调有可能促进TMAO的产生,进而诱导PDAP。尽管炎症和代谢性疾病的发病机制是多因素和高度复杂的,但最近的文献表明,使用益生菌可以调节肠道微生物菌群和免疫反应,有助于预防和治疗心血管疾病、代谢性疾病及感染相关疾病[11]。同时,动物模型验证通过抑制TMAO代谢通路减少血浆TMAO水平,可有效缓解血管病变和肾脏损伤[12]。目前仍未有关于益生菌治疗难治性PDAP相关报道,本研究结果提示,通过补充益生菌调节功能代谢产物含量(如TMAO、SCFA),从而降低与免疫炎症和氧化应激相关的风险,可能是未来治疗难治性PDAP的新方法之一。

尽管两组受试者的α多样性无统计学差异,但难治性PDAP组的香农指数低于普通PD组,提示其肠道菌群的多样性降低;β多样性分析则进一步提示难治性PDAP组与普通PD组的菌群结构存在显著差异。以上数据初步证明了难治性PDAP组肠道微生物群落结构发生了显著变化。部分文献指出人类肠道中微生物种类的丰富度和多样性是健康的一个指标,拥有更高的细菌丰富度和多样性会与更好的营养状况及整体健康状况相对应[13]。因此,本研究结果提示,难治性PDAP组患者的整体健康状况出现下降。

棒状杆菌属、肠球菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、短波单胞菌属等是难治性PDAP组患者的特征性菌群。棒状杆菌属由上百个已知的菌种组成,其中,50%以上的菌种可直接或通过牲畜接触传播造成人体机会性感染[14]。部分棒状杆菌属被认为是人类皮肤菌群的一部分,已被发现对多种药物具有耐药性,并可导致严重甚至是致命的疾病,特别是对免疫功能受损、长期在医院及疗养院生活的患者[15]。肠球菌属是全球卫生保健相关感染的主要病原菌,可引起尿路感染、心内膜炎、手术部位伤口感染、腹膜炎以及导管和其他植入物的感染;并且多药耐药性常见,会延长住院时间,提高治疗费用,增加治疗失败甚至死亡的风险[16]。引起感染的肠球菌属主要有粪肠球菌和屎肠球菌,两者皆不是高毒性致病菌,但可逃避免疫系统的监视,如附着于宿主细胞、细胞外基质和惰性材料(如各种医疗器械);并且可形成生物膜,对抗生素更具抵抗力。假单胞菌属是世界范围内是最广泛存在和具有多样性的细菌属之一,其中铜绿假单胞菌是最常见的人类病原体[17]。铜绿假单胞菌是医院获得性感染的常见病原体,可引起重症肺炎、手术部位感染、尿路感染和菌血症等。同时,随着其耐多药、广泛耐药及泛耐药菌株的日益流行,有限的抗生素治疗选择造成了全球公共卫生威胁[18]。铜绿假单胞菌通过其菌毛和鞭毛攻击宿主,并利用生物膜形成、群体感应和Ⅲ型分泌系统来增加其毒力[19]。葡萄球菌属包括一组多样化的共生菌,在哺乳动物的皮肤或黏膜上定殖,该属中最重要的病原菌为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌,是手术部位和中心静脉导管相关感染的最常见菌种,对医疗保健系统造成巨大的威胁[20]。葡萄球菌属可附着于宿主表面并形成顽固的群落结构,对抗菌治疗和宿主防御具有更强的抵抗力[21]。乳杆菌属由170多个物种组成,是人类和其他哺乳动物微生物群的重要组成部分,也可能造成机会性感染。目前研究发现,发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌可引起腹膜炎[22]。尽管短波单胞菌属在目前不被认为是临床相关的主要病原体,但其诱发的感染通常很难治愈,因为这些细菌对许多不同的抗生素产生耐药性,包括β内酰胺类和氟喹诺酮类。目前已有不少研究证实短波单胞菌属可引起PDAP,除适当的抗生素治疗外,及时移除PD导管是治愈这种感染所不能避免的[23]。国内研究提出PDAP的发生与紊乱的肠道菌群密切相关,与普通PD组患者相比,PDAP组患者致病菌群丰度增加,有益菌群丰度降低[24]。而本研究亦证实难治性PDAP组的特征性菌群主要为各种致病菌,其可对人体造成严重感染。

因病原菌分散等原因,本研究未分析其与肠道菌群的关系,肠道菌群的构成可能影响患者对特定病原体的易感性,而发生腹膜炎后,炎症本身又会影响肠道功能和菌群平衡,病原菌与肠道菌群可能存在动态相互作用,这一点仍需大量深入的研究来验证。另外,本文尚存不足:(1)数据样本量有限,得出的结论仍需进行更多研究来证实。(2)横断面设计无法推断因果,肠道菌群的改变可能是结果而非原因。(3)未收集难治性PDAP患者的临床表现,如恶心、呕吐、腹泻、便秘、大便性状,无法排除上述因素对研究结果的影响。(4)未记录受试者残余肾功能及透析充分性,而其是影响PD患者肠道菌群结构和功能的两个关键因素。(5)未能排除受试者的饮食、药物等混杂因素对肠道菌群构成产生的影响,食物作为菌群的营养底物,其种类与结构对塑造菌群的组成与功能有重大影响,而药物亦可能改变菌群的稳定性。(6)难治性PDAP组患者的白蛋白低于对照组,这可能是炎症状态抑制白蛋白的合成并且加速白蛋白的分解,而低蛋白血症是驱动肠道菌群失调关键因素。低蛋白血症导致血浆胶体渗透压下降,引起肠道黏膜水肿和绒毛结构变平,损害肠道上皮细胞间的紧密连接,增加肠道通透性,为细菌及其代谢产物易位进入血液循环提供通道,加剧全身性微炎症状态;同时,蛋白摄入限制和吸收不良也会影响肠道菌群的代谢。在本研究中,血清白蛋白是至关重要的混杂因素,但本研究没有很好的匹配两组的实验室指标,影响结果的可信度。

小结:与普通PD患者相比,难治性PDAP患者的肠道菌群组成发生改变,棒状杆菌属、肠球菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属等致病菌属较多,而普氏菌属、小杆菌属、消化球菌属、魏斯氏菌属等产生短链脂肪酸的有益肠道微生物较少。尽管本研究无法证明肠道微生物和难治性PDAP 患者之间的因果关系,但为其作为靶点防治难治性PDAP提供了新的思路。

参考文献

[引用本文]陈杏玲、郭婷婷、麦靖怡、粟之花、章俊. 难治性腹膜透析相关性腹膜炎患者的肠道菌群特征[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2025, 34(5): 435-440.

CHEN Xingling, GUO Tingting, MAI Jingyi, SU Zhihua, ZHANG Jun. Characteristics of intestinal flora in patients with refractory peritoneal dialysis associated peritonitis[J]. Chinese Journal of Nephrology, Dialysis & Transplantation, 2025, 34(5): 435-440.