巨噬细胞是先天性免疫系统的组成部分，具有促进损伤愈合、产生活性氧物质和吞噬异物的作用，其功能异常可引起机体免疫反应失调或组织病理性损伤。巨噬细胞有组织驻留型和非组织驻留型两种细胞群体，其共有的显著特征主要是具有分泌功能，包括分泌具有广泛生物学功能的细胞因子、生长因子、免疫炎症因子和趋化因子等。巨噬细胞的另一特征是能够表达特定的细胞表面标志物如F4/80、CD68、iNOS和CD206等[1]。非组织驻留的巨噬细胞主要分布于循环系统内，而驻留型巨噬细胞则主要存在于各个组织器官中，如神经系统的小胶质细胞、肝脏Kupffer细胞、皮肤朗格汉斯细胞和腹腔的巨噬细胞等。巨噬细胞的分化、增殖和极化依赖于特定的生长因子及其受体。巨噬细胞的表型受到其周围微环境的影响，目前已鉴定出两类极化表型的巨噬细胞：M1和M2表型细胞。M1表型细胞，也被称为经典激活的巨噬细胞，表达iNOS，释放促炎细胞因子，如TNFα、IL-1b、IL-6和IL-12；而M2型巨噬细胞，即交替激活的巨噬细胞，表达CD206和Arg-1，负责释放抗炎细胞因子，如IL-10[2]。

巨噬细胞表型与功能活性的这种多样性和复杂性，使得巨噬细胞的体内生物学研究存在一定困难。为解决这一问题，近年采用了一种称为巨噬细胞耗竭的方法来进行研究。巨噬细胞耗竭实际上是一种采用理化或遗传学技术将巨噬细胞去除的方法。这种方法现已广泛用于研究巨噬细胞在动物疾病模型中的作用和免疫病理或炎症损伤机制，也开始用于某些疾病模型如移植排异[3]、肠肿瘤[4]和心功能不全[5]等的治疗研究。在本文中，主要介绍了近年应用较多的几种巨噬细胞耗竭方法及其在肝损伤中的应用。

1.   巨噬细胞耗竭方法

1.1   氯膦酸盐脂质体法

脂质体是具有双层磷脂结构的纳米级囊泡[6]，生物相容性好，不会引起抗原、热原、过敏和毒性反应，易被生物降解，能够封装活性药物，因此被作为载体广泛地应用于药物递送[7]。其中，氯膦酸盐脂质体法是目前最常用的巨噬细胞耗竭方法。

在体内，脂质体封装形式的氯膦酸盐可被巨噬细胞吞噬并摄入细胞内，此时细胞内的溶酶体磷脂酶会消化磷脂双层，释放其中的氯膦酸盐分子。细胞内的氯膦酸盐达到某一阈值浓度时，可抑制ATP依赖性酶，损害并破坏细胞能量代谢，导致巨噬细胞凋亡[8]。此外，氯膦酸盐半衰期很短，也难以透过细胞膜，对非吞噬细胞无明显毒性作用，故通过选择给药途径可以获得器官特异性的巨噬细胞消耗。例如，皮下注射氯膦酸盐脂质体能够耗竭小鼠引流淋巴结中的巨噬细胞[8]；静脉注射氯膦酸盐脂质体可以耗竭肝脏、脾、骨髓和血液中的巨噬细胞[9]。

脂质体包封药物对巨噬细胞耗竭维持时间较短。肝内Kupffer细胞耗尽后，新的Kupffer细胞会在1周左右重新出现[6]。为了达到较长时间去除巨噬细胞的目的，现多采用多次用药的方式解决。该方法中首次注射脂质体封装的氯膦酸盐剂量为200 μL，之后每隔4 d减量至100 μL注射[10]。但是重复使用可导致中性粒细胞增多、贫血以及促炎因子IL-6和IL-1β的表达增加[11]。

1.2   GdCl3注射方法

GdCl3酸性溶液静脉注射时在溶酶体中被解离成游离的Gd3+，这些游离的Gd3+颗粒能够被Kupffer细胞吸收并促使其自身凋亡[12]。Bloomer等[13]证实GdCl3可减少巨噬细胞特异性标志物如CD206的表达，并损害肝脏中巨噬细胞的吞噬功能。GdCl3溶液腹腔给药可以耗尽Kupffer细胞以及静脉途径给药可以抑制巨噬细胞在肝脏的浸润和活化[14-15]。然而，GdCl3对结肠黏膜巨噬细胞无明显的耗竭作用[16]。长期给予GdCl3对肝功能或动物存活的影响很小，这表明它是一种安全的实验试剂，可为巨噬细胞耗竭提供一种有前途的策略。

1.3   阻断集落刺激因子-1及其受体(CSF-1/CSF-1R)信号方法

CSF-1是由c-fms基因编码的巨噬细胞特异性生长因子[17]，主要产生于中性粒细胞、肝星状细胞、胸腺基质细胞、脂肪组织源性和肝源性间皮细胞、成骨细胞和神经元[18-20]。巨噬细胞的产生、增殖和存活依赖于CSF-1，并在其细胞表面高水平表达CSF-1R(CD115)。CSF-1能够通过CSF-1R酪氨酸激酶的自身磷酸化和随后下游分子的磷酸化来发挥其生物学功能。因此，以CSF-1/CSF-1R为靶点的方法也成为巨噬细胞耗竭的一种重要手段。

GW2580是一种选择性CSF-1R酪氨酸激酶抑制剂，常被用来研究小胶质细胞在疾病中的作用。CSF-1能够与小胶质细胞表达的CSF-1R结合，导致酪氨酸受体激酶二聚化和自磷酸化，并触发调节生存的ERK和AKT通路的激活。GW2580对小鼠的治疗诱导了小胶质细胞中增殖相关转录和炎症相关基因的下调，这可能是减少脊髓损伤后的神经炎症和促进功能恢复的原因[21]。除此之外，GW2580还能够耗竭肾脏、脾脏及腹膜腔的巨噬细胞，但是对循环中的单核细胞没有影响[22]。类似地，CSF-1R的小分子抑制剂PLX3397和SU11248也可有效去除巨噬细胞[23-24]。

巨噬细胞特异性基因敲除和点突变模型是全面了解单核吞噬细胞群在宿主组织稳态及病理条件下功能的重要工具。Kupffer细胞是完全依赖于CSF-1的组织驻留巨噬细胞[25]，因此，Csf基因自发突变小鼠(Csf1op/Csf1op)模型是研究Kupffer细胞在体内功能的有效工具。即使是在CSF-1缺失的情况下，巨噬细胞的分化和存活也能由IL-34通过其共同的受体CSF-1R代偿[26]，这可能也是相比于Csf1op/Csf1op小鼠，Csf-1r基因敲除小鼠(Csf1r-/Csf1r-)表现出更严重的巨噬细胞耗竭的原因[27-28]。

1.4   巨噬细胞耗竭转基因模型

转基因小鼠通过特定方法在其基因组中引入外源DNA，并驱动表达具有特定功能的基因以达到某种生物学功能。因此，巨噬细胞耗竭也可以通过转基因动物模型实现。基于白喉毒素受体(DTR)的转基因小鼠是目前应用最多的用于巨噬细胞耗竭的转基因模型。小鼠细胞由于缺乏对白喉毒素(DT)的功能性细胞表面受体，因此对DT具有天然的抵抗力。通过人DTR转导技术能够在体内通过DT给药实现对特定类型的小鼠细胞的有效诱导消融[29]。例如，施用DT使得CD11b-DTR转基因小鼠选择性地耗尽巨噬细胞及其他髓系细胞如单核细胞、破骨细胞、小胶质细胞和树突状细胞等[30]。

目前，尚没有任何理化手段可以达到在不干扰整个单核巨噬细胞系统的情况下选择性地只耗竭组织驻留的巨噬细胞，因此，研究人员提出了基于细胞特异的基因设计靶向耗竭组织驻留巨噬细胞的方案。Clec4f是Kupffer细胞特异性表达的基因，参与Kupffer细胞的糖脂呈递过程[31]。Scott等[32]设计了基于Clec4f基因的KC-DTR巨噬细胞耗竭模型，旨在排除其他单核巨噬细胞系统细胞耗竭对实验的影响。不仅如此，由于基因的特异性，该模型还实现了对Kupffer细胞100%的耗竭效率[32]。类似地，Slco2b1-flox/DTR转基因小鼠被设计用于间质巨噬细胞的耗竭[33]。

M2型巨噬细胞由于具有强大的免疫调节和抗炎作用，在过去十年引起了越来越多的关注。Mrc1是表达于M2亚群的特异性标记基因[29]，因此，Kambara等[2]建立了Mrc1基因启动子控制下表达人DTR的转基因小鼠。CD206，又称甘露糖受体，主要表达于M2型巨噬细胞和未成熟树突状细胞表面[34]。实验结果表明在转基因小鼠上给予DT可以引起CD206阳性细胞的条件性消融，这意味着在体内平衡条件下M2极化的巨噬细胞可以被有效地耗尽[2]。

另一个应用较为广泛的转基因模型是Fas诱导巨噬细胞凋亡(macrophage Fas-induced apoptosis, MAFIA)转基因小鼠模型。MAFIA转基因小鼠的巨噬细胞表达在Csf1r启动子的控制下驱动自杀基因Fas的表达[35]。转基因插入物包含突变的人FK506结合蛋白1A(FKBP12)，它能够优先结合小分子耦合物AP20187，激活caspase-8途径并且使得巨噬细胞Fas结构域交叉连接，从而诱导程序性巨噬细胞凋亡[36]。尽管MAFIA转基因小鼠的脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞也表达FKBP12，但由于AP20187不能通过血脑屏障，该转基因模型不能用于小胶质细胞和星形胶质细胞相关疾病的研究[37]。

研究[38]表明，MAFIA转基因小鼠巨噬细胞耗竭模型可获得95%以上的巨噬细胞耗竭效率。目前，该模型所耗竭的巨噬细胞亚型以M2型为主。Bailey等[39]研究表明在巨噬细胞耗竭的MAFIA小鼠中，关节内巨噬细胞短暂地耗竭显著增加了M1型巨噬细胞的数量，M2型巨噬细胞的数量则呈现下降趋势。目前对于巨噬细胞耗竭模型中极性变化的机制尚不明了。

2.   巨噬细胞耗竭与肝损伤

肝巨噬细胞包括组织驻留巨噬细胞和由趋化因子招募的循环单核细胞。Kupffer细胞是肝脏驻留的巨噬细胞，是肝脏微环境中细胞因子和生长因子的主要来源，因此，在调节肝脏免疫及炎症中具有重要作用。Kupffer细胞是肝脏的主要免疫细胞，通过去除该细胞或抑制其功能可以探索其在肝损伤中的作用。

大多数研究证明，Kupffer细胞耗竭或抑制其功能在肝脏中发挥保护性作用(图 1)。Schümann等[40]的研究表明，在去除Kupffer细胞的情况下，肝损伤仅限于少数几个小坏死区。Guo等[15]发现GdCl3处理的小鼠口服氨苄西林可降低门静脉血中的内毒素水平，并减轻肝损伤。Kupffer细胞的早期激活促进了活性氧物质和促炎介质的形成。GdCl3对Kupffer细胞激活的抑制作用在体内肝脏再灌注损伤的大鼠模型中显示出潜在的肝脏保护作用[41]。

图  1  巨噬细胞耗竭的肝保护作用机制

注：LncRNA-H19，长链非编码RNA-H19；MMP-12，基质金属蛋白酶-12。

慢性肝损伤经常导致肝星状细胞的激活和肝纤维化的进展。大量研究[6]证明，抑制Kupffer细胞能明显降低肝酶活性，改善肝纤维化。因此，Kupffer细胞在与肝纤维化相关的炎症中起着关键作用。相关光电子显微镜下可见Kupffer细胞与位于窦周隙的肝星状细胞相互作用[20]，证明Kupffer细胞在调节肝星状细胞以及促进肝纤维化中具有重要作用。TNFα和IL-1是激活肝星状细胞的主要细胞因子[20]。研究[40, 42]表明，巨噬细胞耗竭能够显著降低Kupffer细胞来源的促炎性细胞因子，如IL-1和TNFα的水平，提示Kupffer细胞耗竭通过旁分泌作用调节肝星状细胞，从而改善肝纤维化。LncRNA-H19被证明能够抑制肝细胞胆汁酸失调以及激活肝星状细胞促进肝纤维化[43]。Tian等[44]发现巨噬细胞耗竭能够显著降低肝脏中LncRNA-H19的表达，从而抑制胆管结扎所诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化。此外，Pradere等[45]研究发现，肝巨噬细胞以一种依赖于NF-κB的方式增强肝星状细胞的存活。相反，体内纤维化形成过程中巨噬细胞的耗尽会导致肝星状细胞中的NF-κB活性受到抑制。

肝脏的纤维间隔存在丰富的胶原和成熟的弹性蛋白。弹性蛋白的降解能够促进肝纤维化的进展，而MMP-12在调节弹性蛋白中具有重要作用。巨噬细胞耗竭实验[46]表明，巨噬细胞是MMP-12的唯一来源，这提示巨噬细胞可能通过产生MMP-12介导弹性蛋白降解从而加重肝纤维化。CD206作为模式识别受体调节巨噬细胞吞噬作用，它能够内化巨噬细胞和肝窦细胞中的胶原蛋白，这在纤维化中起着至关重要的作用。GdCl3处理后，CD206在小鼠肝脏中的表达下调，促进CD206阳性细胞的凋亡，从而缓解肝纤维化[47]。

肌成纤维细胞由肝星状细胞激活后转分化而来，能够分泌大量细胞外基质，是肝纤维化进展的重要环节。因此，抗纤维化治疗的主要目标之一是开发一种以成纤维细胞为靶标的药物递送系统，以抑制肝纤维化。最新采用膜融合技术开发了氯膦酸盐-尼达尼布(NIN)-外泌体-脂质体杂交纳米颗粒(CLD/NIN@LIEV)，该方法搭载了靶向成纤维细胞的药物NIN[6]。细胞外囊泡(EV)是成纤维细胞来源的外泌体，对肝成纤维细胞具有同源归巢作用，从而增强NIN作用的靶向性。CLD/NIN@LIEV中的氯膦酸盐一方面抑制肝脏Kupffer细胞活性，减少Kupffer细胞对纳米颗粒的非特异性吞噬作用，进一步增加NIN向成纤维细胞的传递；另一方面抑制Kupffer细胞分泌炎性细胞因子，缓解肝脏炎症及延缓纤维化进展。

目前，M1和M2型巨噬细胞极化已经被证明在炎症和肝损伤的进展中发挥重要作用，因此利用转基因巨噬细胞耗竭模型实现对特定巨噬细胞亚型的耗竭有利于探索不同亚型巨噬细胞和疾病的关系。笔者团队[48]首次提出了“Ces1f可能通过Kupffer细胞M1极化介导急性肝衰竭肝组织炎症损伤”的假说，因此，采用巨噬细胞耗竭有希望能够进一步探索Ces1f与肝脏M1型巨噬细胞之间的关系。

3.   小结

肝巨噬细胞在慢性肝损伤的发病机制中起着重要作用，并被认为是肝损伤治疗的潜在靶点。这些作用包括清除病原体或细胞碎片；在损伤反应中释放抗炎细胞因子；在慢性肝损伤中调节非实质性肝细胞群及免疫细胞。了解巨噬细胞耗竭促进肝损伤的机制，无论是通过抑制外周单核细胞浸润，还是通过抑制Kupffer细胞功能或巨噬细胞极化，可能有助于开发新的针对肝损伤和纤维化的方案。

然而巨噬细胞耗竭中存在一些问题，比如，巨噬细胞耗竭效率难以量化、耗竭的亚型难以确定、耗竭对象不具有特异性即可能会损伤除巨噬细胞外的其他免疫及非免疫细胞。氯膦酸盐脂质体法作为当前应用最为广泛的巨噬细胞耗竭方法，尽管具有经济、制备简单的优点，但其对巨噬细胞耗竭效率差异很大(通常50%~95%)，研究结果的可靠性有待评估[38]。目前，巨噬细胞耗竭作为一种建立模型的方法被应用于大量的实验研究，几乎所有的方法都有其缺陷，以至于很多相似的实验得出不同的实验结果。实验结果的不严谨一方面是未选择符合自身实验设计的耗竭方法，另一方面是巨噬细胞耗竭方法本身就具有很多局限性，例如，Csf-1r基因敲除模型中CSF-1R除了能够在巨噬细胞表达，还能在树突状细胞和单核细胞表达[49]。如果不能排除其他免疫细胞对实验的影响，该方法则不具有严谨性。转基因模型能够基于细胞特异的基因设计靶向特定巨噬细胞亚型的方案，具有耗竭效率高以及耗竭特异性强的优势，然而转基因小鼠价格昂贵及繁育周期长是实验设计需要考虑的重要影响因素。巨噬细胞耗竭方法的主要局限性严重阻碍了对巨噬细胞是否真正参与疾病进展的判定。因此，亟需探索出能够最大程度地减少包含任何潜在混杂因素的巨噬细胞耗竭模型，从而最终确定巨噬细胞在各种疾病发病机制中的作用。