2.外泌体miRNA在肝炎病毒复制与传播过程中的作用

病毒性肝炎是世界范围内常见的疾病，主要由五种肝炎病毒引起：甲型、乙型、丙型、丁型、戊型。来源于感染肝炎病毒肝细胞的外泌体有助于病毒的传播，并损害机体对病毒性肝炎的先天免疫反应[11]。HAV能劫持宿主细胞内体囊泡，并将其病毒颗粒包装于所形成的外泌体中，以促进自身复制和传播[12]。早期有报道[13]称，miR-199a-3p和miR-210(二者均可存在外泌体中)的表达上调，能够有效抑制HBV复制。此外，在HBV感染者中，HBV编码的miRNA(HBV-miR-3)能通过外泌体携带释放进入循环，而HBV-miR-3可抑制HBV复制和蛋白质的产生[14]。

Ramakrishnaiah等[15]发现，HCV通过外泌体转运，实现在肝细胞之间的传播。Bukong等[16]也发现，从HCV及HCV感染者的肝细胞株Huh7.5分离的外泌体中存在HCV RNA，而外泌体miR-122能够与进入外泌体的HCV RNA、Ago2、HSP90结合形成复合物，增强HCV RNA稳定性并促进复制和传播。此外，含有HCV的外泌体能够通过STAT3-miR124轴诱导RUNXOR和RUNX1表达上调，从而帮助病毒逃避宿主免疫反应[17]。机体感染HCV后，Toll样受体3(TLR3)能够激活肝巨噬细胞产生外泌体抗病毒miRNA，如miR-29。当外泌体释放并被其他肝细胞吸收后，其内的抗病毒miRNA能够诱导抗HCV反应或直接靶向作用于HCV基因表达[18]。

3.   外泌体miRNA对肝纤维化进程的调控

随着病毒性肝炎进一步发展，肝脏出现纤维化表现，其特征是细胞外基质(ECM)过度沉积。肝星状细胞(HSC)在肝纤维化过程中被激活，是整个纤维化过程的主要参与者。HSC能分泌外泌体，并且能被其他细胞释放的外泌体激活。在静止的HSC中，外泌体miR-214和miR-199a-5p在碱性螺旋-环-螺旋转录因子1调节下高表达，能抑制结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CCN)2的mRNA表达水平以及下游纤维化信号传导，从而抑制纤维化进展；而在激活的HSC中，外泌体miR-214和miR-199a-5p水平较低，CCN2表达升高，胶原蛋白1α沉积增加，从而促进纤维化进程[19-20]。通过使用棕榈酸处理刺激肝细胞中外泌体的产生，发现外泌体中的miR-122、miR-24、miR-19b、miR3-4a和miR-192水平显著增加；而HSC摄取棕榈酸处理的肝细胞来源外泌体后，其纤维化相关基因表达显著升高[21]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一种多能干细胞，通过分泌多种细胞因子发挥作用。有报道[22]称，MSC来源的外泌体miR-181-5p可以通过激活自噬来抑制肝纤维化进展。最新的一项研究[23]表明，miR-618能通过外泌体从MSC转移到肝星状细胞系LX-2细胞内，并且靶向负调控Smad4基因表达，抑制LX-2细胞的活力和迁移，从而缓解肝纤维化的进展。与此类似的是，较早的研究[24]也发现，miR-192可以通过肝细胞衍生的HCV相关外泌体转移至HSC内，并上调转化生长因子β1(TGFβ1)水平进而促进HSC转分化为肌成纤维细胞。

4.   外泌体miRNA对病毒性肝炎相关HCC增殖、转移的影响

病毒性肝炎所致纤维化长期发展，最终可进展成为肝硬化或HCC。

4.1   外泌体miRNA与HCC肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)

TME由肿瘤细胞周围的ECM、毛细血管、基底膜、活化的成纤维细胞和免疫细胞构成，其有助于肿瘤的进展。既往研究[25-26]已证实，TME中不同类型的基质细胞可以通过转移外泌体miRNA与肿瘤细胞进行细胞间通讯。在类似TME的活化LX-2细胞和HCC细胞共培养系统中，LX-2细胞中外泌体和miR-148a-3p水平均降低，促进了HCC细胞的增殖和侵袭；而当HCC细胞摄取过表达miR-148a-3p的外泌体后，肿瘤发展受到显著抑制[27]。众所周知，环境化学物质可以诱导正常细胞向病理细胞的转变。由亚砷酸盐转化的人肝上皮细胞L-02分泌的外泌体miR-155能够诱导正常肝细胞中炎症因子IL-6和IL-8高表达，而IL-6与亚砷酸盐诱导的致癌作用密切相关[28]。

4.2   外泌体miRNA与癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)

CAF可通过增加血管生成、增殖、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)和逃避免疫监视来促进HCC进展[29]。活化的HSC是肝脏中CAF的主要来源。HCC细胞来源外泌体miR-21能直接靶向HSC内肿瘤抑制基因PTEN，降低其翻译产物磷酸化水平，导致HSC中PDK1/AKT信号通路激活，促进HSC活化为CAF[30]。据报道[31]，高转移性HCC细胞分泌的外泌体miR-1247-3p能直接靶向成纤维细胞内的β-1, 4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)，通过激活B4GALT3/β1-整合素/NF-κB轴，诱导成纤维细胞活化为CAF，促进HCC肺转移。另外，由CAF分泌的外泌体miRNA也能够影响TME内HCC细胞的生长和表型[32]。一项研究[33]表明，CAF来源外泌体miR-150-3p的缺失极大地促进了HCC的进展，并且血浆低水平外泌体miR-150-3p的患者存活率显著低于高水平患者。

4.3   外泌体miRNA与HCC细胞EMT

包括HCC在内的癌转移是一个多步骤过程。EMT是肿瘤细胞获得转移、侵袭能力的重要条件，其特征是上皮样特征的丧失和间充质样属性的获得。外泌体miRNA能通过影响EMT过程间接影响HCC发展。miR-320a是一种抗肿瘤miRNA。Xie等[34]研究发现，miR-320a在HCC样本和HCC细胞系中均显著下调，而促癌基因c-Myc却表达上调。进一步研究发现，c-Myc是miR-320a的直接靶点，miR-320a能通过抑制c-Myc表达来抑制HCC的增殖和转移[34]。miR-320a与HCC细胞EMT也有着重大关联。近期的一项研究[35]发现，外泌体miR-320a可以通过与其直接下游靶标PBX3结合来抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活，进而抑制EMT过程，最终使HCC细胞的增殖、迁移受到抑制。该团队进一步研究[35]发现，CAF来源外泌体中miR-320a水平显著降低，miR-320a-PBX3-MAPK信号通路受到抑制，诱导了EMT发生以及细胞周期蛋白依赖性激酶2和基质金属蛋白酶2的表达，促进了HCC细胞的生长和转移。此外，使用TGFβ诱导HCC细胞系Hep3B细胞EMT发生，发现Hep3B细胞来源外泌体中miR-374a-5p水平显著增加，并且促进了HCC癌细胞的增殖和转移；而在干扰miR-374a-5p表达后会抑制HCC癌细胞的增殖和迁移[36]。

4.4   外泌体miRNA与HCC肿瘤组织新生血管形成

成熟癌细胞往往通过循环途径转移至其他组织或器官，新生血管的形成对于癌组织的生长和转移至关重要。Lin等[37]发现，HCC患者血清中miR-210水平与HCC组织中的微血管密度相关。进一步的体内、体外研究[38]发现，HCC细胞分泌的外泌体miR-210可以运输至血管内皮细胞中，靶向抑制SMAD4和STAT6基因，导致二者蛋白产物水平降低，进而促进肿瘤组织血管生成。此外，HCC细胞分泌的外泌体miR-103也可以进入血管内皮细胞中，通过靶向抑制内皮细胞-细胞接触黏附分子VE-Cad、p120-catenin (p120)和ZO-1的表达，破坏内皮细胞连接的完整性，从而增加血管通透性，促进肿瘤的转移。

总而言之，外泌体miRNA在病毒性肝炎所致HCC的起始、形成、成熟和转移整个过程中都有着重要作用(表 1，图 1)。

表  1  部分外泌体miRNA对HCC的影响

Table  1.  Effects of some exosomal miRNAs on HCC

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图  1  外泌体miRNA与病毒性肝炎相关HCC的关系

Figure  1.  Relationship between exosomal miRNAs and viral hepatitis-related HCC

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5.   小结和展望

关于外泌体治疗HCC的策略已经有了大量研究，然而对于外泌体miRNA在病毒性肝炎所致HCC发生发展中的作用研究尚为有限，尤其是其在炎-癌转化过程中的作用仍然需要进一步探索。其他细胞来源外泌体在被病毒性肝炎感染的肝细胞摄取后，其内所含miRNA对肝细胞内糖基转移酶基因及其mRNA表达水平的调节，可能是影响感染肝细胞向癌细胞转变过程中表型和功能发生改变的重要因素。