意义未明变异（VUS）的解读

本次大会的主题之一是“神经肌病的表型和基因多样性”。随着高通量技术的发展，基因变异的数量迅速增加，基因与临床表型相关性解释迎来了巨大挑战。尽管美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）提供了基因变异分类的标准和指南，但由于神经肌病的罕见性、表型变异以及功能学研究的复杂性，评价和解释VUS仍有很大的困难。

Yale大学的Lek教授作了题为“High throughput functional assays to improve interpretation f rare variants discovered in neuromuscular disease genes”的报告，展示了一种高通量功能验证的方法，以改进对神经肌肉疾病基因中发现的罕见变异的解释。

以FKRP为例开发了一种饱和突变-强化功能分析（Saturation Mutagenesis-Reinforced Functional assays, SMuRF）工作流程：构建FKRP-KO/DAG1（dystroglycan）过表达的HAP1细胞系；使用经过饱和突变的FKRP蛋白的不同点突变来挽救细胞表型；使用IIH6C4抗体流式细胞术检测不同细胞系中糖基化a-DG的荧光强度；对荧光强度明显增高或减低的细胞系进行基因测序，以确定不同FKRP基因VUS变异对a-DG糖基化功能的影响，即其在LGMDR9/2I中的致病性。

通过这一工作流程成功地对FKRP和LARGE1基因中99.5％以上的可能单核苷酸变异（SNV）进行了功能评分。SMuRF的结果表明，FKRP基因催化域和LARGE1基因的XylT结构域错义变异更可能具有致病性。

来自Washington大学的Weihl教授作了题为“Understanding genetic variants in neuromuscular disorders”的报告。

尽管目前可使用WES（全外显子测序）、WGS（全基因组测序）、RNA测序及长读长（LRS）等高通量测序技术，仍有相当比例的肌营养不良患者无法明确基因诊断。更具挑战性的是，许多变异都被归类为VUS，难以解释其与临床表型之间的关系，对这些VUS进一步分类至关重要。ClinGen项目旨在明确基因与疾病之间的关联，评估基因变异的致病性，并提供相关信息以供后续临床操作。

以LGMDR4/2E为例，Weihl教授研究团队在HEK人细胞中进行了SGCB基因变异的功能异常检测。研究步骤包括：构建SGCB突变文库质粒并转染慢病毒；对转染细胞进行YFP和HA抗体染色和成像，携带致病突变体（G167S）的细胞无法有效地将细胞内SGCB（绿色）运输到细胞表面（红色），而WT总蛋白质和细胞表面SGCB的表达阳性；HA染色将转染细胞分选为4个象限，对每个象限细胞进行测序和DMS（deep mutational scan）功能评分；得到不同基因变异的DMS功能评分。

这一方法可高度敏感而特异地评估SGCB变异的致病性。DMS评分不仅与疾病严重程度相关，还有望在基因治疗的疗效预测方面发挥重要作用。

神经肌病诊断

来自芬兰的学者对TTN变异的负荷进行了解读。人群中高达1%的人携带TTN截短变异（TTNtv），而高达16-20%的人携带非常罕见的错义变异。在Solve-RD项目中，共发现102名单杂合TTNtv携带者（占1.2%），其中70名患者同时携带这一变异并患有遗传性疾病，而32名健康亲属也携带了这一变异。

然而，大部分携带TTNtv的人并没有心肌病表型，仅有2名患者伴有心脏受累，而仅有5名患者（占5.8%）接受了心脏评估并被排除了心肌病。研究者建议综合评估临床、病理、影像学、转录组和蛋白功能结果，以对携带TTN变异的患者和家庭进行适当的管理和遗传咨询。

来自德国的研究者通过RNA-seq对遗传性神经肌病进行了诊断效率的研究。他们纳入了14例曾行基因检测但尚未明确诊断的患者。通过RNA-seq，他们在1例患者中发现了影响SGC剪切的纯合VUS变异c.37+6T>C。迷你基因功能检测进一步验证了上述改变，其他患者的RNA-seq结果仍在分析中。

来自德国的研究者开展了LiBi-NMD项目，旨在系统评估白细胞（WBC）液体活检在研究神经肌肉疾病病因学方面的价值。他们使用质谱对WBC中的蛋白组进行分析，探索了液体活检的潜力：评估超微结构异常；评估VUS的致病性；识别与疾病相关的病理生理过程以及监测疾病的进展。

简讯

总之，以上研究和方法为神经肌病的诊断和基因分析提供了新的视角和工具，有望提高对这些疾病的理解和诊断效率。

撰稿：奚剑英 复旦大学附属华山医院神经内科

审核：奚剑英 复旦大学附属华山医院神经内科