常用呼吸道病原检测技术简介 

作者：邹晓辉

呼吸道感染是人群中最常见和高发的疾病之一，给全社会造成重大的疾病负担。呼吸道感染的病原体种类多样，病毒、细菌、真菌均可导致感染。快速准确的病原检测可以指导临床针对性抗感染治疗，提升临床治疗效果。目前临床常用的呼吸道病原检测技术包括传统的培养、涂片显微镜镜检、抗原抗体检测，以及分子生物学方法中的PCR方法。近年来，基于二代测序的临床宏基因组方法（mNGS）和质谱等技术进展迅速，也越来越多用于呼吸道病原体的检测。

传统的病原微生物检测方法主要是依据病原体本身性质、生长条件进行染色、培养、生化反应，并在此基础上进行鉴定，以便能够鉴别不同种类的微生物。传统检测方式主要包括涂片镜检、培养基分离培养与组织细胞培养三种。传统检测方法在临床应用时间长，检测的准确性高，很多可以当成病原检测的“金标准”，但普遍存在灵敏度低，操作繁杂，难以实现自动化高通量检测。

病原微生物体形体积微小，大部分无色难以观察到。涂片染色和显微镜检查可以观察微生物体的外形、大小、结构和排列方式，对于快速初步诊断至关重要。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、隐球菌等的初步诊断。涂片镜检不需要特殊的仪器和设备，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。

涂片镜检几乎可以处理临床所有样本，包括血液、痰、尿液、粪便、脑脊液、胸腔积液、腹水、关节液、脓液、生殖道分泌物，血管内导管、支气管肺泡灌洗液、保护性毛刷、腹透液、组织、假体等常见微生物组检测样本。染色方法包括革兰染色、抗酸杆菌染色(萋尼染色)、墨汁染色、弱抗酸染色、10%氢氧化钾（KOH）直接压片、乳酸棉酚兰染色等。

革兰染色检查普通细菌，适用于除血液、导管、粪便、喉部标本外的各种标本。革兰染色可查念珠菌，但不适用于丝状真菌。抗酸染色检查抗酸杆菌适用于除血液和导管外的各种标本，其中呼吸道标本最常见。弱抗酸染色检查奴卡菌，主要适用于呼吸道、中枢神经系统标本。10%KOH和（或）乳酸棉酚兰染色检查真菌；墨汁染色检查脑脊液标本中的新型隐球菌。六胺银染色检查呼吸道标本中的人肺孢子菌。

常规微生物培养是病原学检测的金标准之一，通过合适的培养基可以对常见细菌、真菌、病毒有效分离培养，用于鉴定和进一步的研究。培养法的优势之一是可以分离到活的病原体用于后续的药物敏感性检测和动物试验等研究，是分子检测和免疫学检测无法取代的。但培养法一般需要接种、培养、鉴定等多个步骤，耗时费力，对临床技能要求较高，难以大规模高通量检测。

分离培养法在细菌和真菌的病原学检测上应用广泛，多用于痰液、粪便、血液、体液等，由于细菌生长和繁殖的时间比较长，一般需要24~48 h才能生长出来，且不可批量处理。呼吸道样本的培养常常伴随着大量呼吸道正常菌群，这就要求临检人员熟悉致病性微生物的外观，能从大量正常菌群中识别出致病性微生物，对检测人员业务能力要求高。

呼吸道样本培养适用于奴卡菌、炭疽芽孢杆菌、新型隐球菌、丝状真菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌等；对于住院患者，铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、伯克霍尔德菌属常见。其他常见细菌还包括金黄色葡萄球菌、成人GBS、C和G群链球菌、革兰阴性杆菌中的肺炎克雷伯菌等。

组织细胞培养主要用于呼吸道病毒的分离培养和鉴定，由于需要二级生物安全实验室，且对检测人员实验室技能要求较高，在医疗单位应用较少。目前呼吸道病毒的检测主要依靠分子检测方法。

免疫学检测主要检测病原微生物抗原和感染后宿主产生的抗体，用来判断患者是否发生该病原体的感染。抗原是病原微生物体内的特定分子结构，可以被免疫系统识别并产生抗体，抗原检测用于检测体内是否存在特定病原微生物的抗原。常见的方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫荧光法（IFA）、放射免疫分析法（RIA）等。

临床常用胶体金试纸条来检测呼吸道病毒，该方法操作简单，只需要把样本滴到检测条上，样本在吸水纸的作用下流过检测靶标线，当发生抗原抗体结合时，试纸上的胶体金颗粒发生聚集，引起试纸条的颜色变化，从而显示出条带。该方法操作简单，无需特殊仪器，反应快速，一般在15分钟内就可以获得结果，适合居家检测、门诊快速筛查、床旁检测等。

胶体金抗原检测可用于常见的呼吸道病毒和非典型病原体，如流感病毒，腺病毒，呼吸道合胞病毒以及支原体检测等。此外，胶体金抗原检测还大规模用于新冠病毒的筛查和居家检测。胶体金方法虽然简单快速，但灵敏度一般低于分子检测方法；其阳性结果可以作为明确诊断的依据，但阴性结果并不能作为排除感染的依据。

除了呼吸道样本的胶体金抗原检测，尿抗原检测常常用于肺炎链球菌和军团菌的检测，血液和脑脊液还可以用于隐球菌抗原的检测。

抗体一般在感染后7天左右开始上升，在恢复期抗体滴度最高，因此，恢复期抗体滴度相比急性期4倍升高可以作为感染的依据。但由于抗体在急性期滴度低，急性期抗体检测临床意义有限，一般用于流行病学监测以及患者既往感染的鉴定，急性期病原检测首选其他检测方法。

病原分子检测是指应用分子生物学方法检测病原微生物的遗传物质（DNA/RNA）或表达水平，具有特成本低、特异性好、灵敏度高、容易自动化标准化等特点，是目前病原微生物检测应用最为广泛的技术。

PCR方法采用两条特异性引物（上游引物、下游引物）对病原微生物的目标片段进行扩增，扩增产物可以用电泳或者毛细管电泳检测。目前临床常用荧光定量PCR，该方法在反应体系中加入了荧光染料，可以插入到DNA产物中发出荧光。这样在每一轮PCR循环都可以监测到产物的生成量，观察模板中是否存在特定的微生物序列，进而判断是否发生特定微生物感染。除了使用非特异性的DNA染料，还可以采用Taqman探针的方法来标记扩增产物荧光。Taqman探针法需要上下游引物和探针均与模版匹配时才能发生反应，因而特异性更好。

将不同的Taqman探针标记不同的荧光探针，可以实现一次反应检测多个靶点。如新冠核酸检测试剂盒一般需要检测三个靶标，orfab、E基因和宿主内参基因，这3个探针一般分别用FAM、HEX和ROX（不同试剂盒有不同的染料组合）3种荧光基团来标记。

基因芯片也叫微阵列芯片，上面预先固定了病原微生物的特异性DNA或RNA序列，也叫探针，可以同时检测数千到数百万种基因序列。当样本中存在靶标序列时，就会与基因芯片上的探针互补配对，产生信号被仪器捕获到。基因芯片上可以固定成千上万条探针，因而非常适合用来做多靶标的检测。但该方法一般需要目标序列扩增，杂交，显色等多个步骤，流程较为复杂，目前应用较少。

随着质谱和高通量测序技术的进步，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和临床宏基因组技术在病原微生物检测上应用越来越广，极大地提升了临床检测能力。

传统的病原微生物分子检测需要预先推定感染的微生物类别，随后针对性地去检测该微生物。然而可以造成呼吸道感染的病原微生物种类多样，临床症状不典型，很难准确预判何种病原感染。mNGS技术可以对样品所有微生物和宿主的DNA和RNA进行测序，从而能够分析样本中所有的微生物种类，进而锁定病原微生物。由于mNGS无需预设靶标，因而理论上可以对样本中所有病原微生物一次性全部检出，在常规检测方法阴性、混合感染的复杂病例，以及新型/罕见病原体检测方面具有明显优势。

尽管在mNGS技术能够更加全面的检测病原，但也存在报告解释困难、缺乏标准化等不足之处。

因此，mNGS技术不能替代传统检测方法，有其严格的适用范围。

质谱技术（Mass Spectrometry，简称MS）根据质量-电荷比（m/z）对病原微生物分子进行分离、检测和定量，从而鉴定微生物种类、测定分子的结构、定量分析以及研究分子的相互作用等。MALDI-TOF质谱已经广泛用于临床培养的细菌、真菌鉴定，可以在1分钟内得到鉴定。

在使用时，质谱仪会将样本中的分子离子化，并根据其分子质量和荷电量进行分离和检测，生成一个质谱图谱，其中记录了样本中各种分子的质量和丰度。将样本的质谱图谱与已知微生物的数据库进行比对，即可以确定样本中的微生物种类。

微生物质谱检测具有快速、高通量和高灵敏度的特点，能够在短时间内对微生物进行鉴定。这项技术在临床诊断、食品安全、环境监测等领域应用广泛，可以帮助快速识别微生物，提高疾病诊断的准确性和效率。

CRISPR-Cas分子检测技术是一种基于CRISPR-Cas系统的方法，用于检测特定的核酸序列，如DNA或RNA。CRISPR-Cas系统最初是一种用于细菌和古菌的天然免疫机制，后来被开发成为基因编辑工具。CRISPR-Cas系统也可以用来进行特异性的核酸检测，从而识别目标序列的存在。

该方法需要首先设计一个CRISPR引导RNA（gRNA），该gRNA可以与目标序列特异性地结合。这使得CRISPR-Cas系统能够定位到目标序列。在存在目标序列的情况下，CRISPR-Cas系统会被激活，Cas蛋白会被激活并表现出特定的核酸酶活性。激活的Cas蛋白酶活性可以导致目标序列的切割，也可以与其他分子（如DNA或RNA引物）一起用于目标序列的放大，产生一个可以检测的信号。使用不同的检测方法可以识别这种信号，例如，可以使用凝胶电泳、荧光探针、比色试剂等进行信号检测。

CRISPR-Cas分子检测技术具有高特异性、高灵敏度和快速的优点。它可以用于检测特定的基因、病原体、突变等，对于临床诊断、疫情监测、基因突变分析等领域具有重要的应用潜力。但该方法使用较为复杂，目前在临床上还未推广开。