高 清1,2,3 卢美琪1 陈怡萱3 林梦舒3 王科嘉2

摘 要

目的:探讨在高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞(MGMC)中lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p结合对炎症、纤维化和增殖的影响。

方法:qRT-PCR测定低糖组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)和高糖组(25 mmol/L葡萄糖)MGMC中miR-7214-3p的表达水平;生物信息学预测lncRNA-Gm4419与 miR-7214-3p的结合位点;荧光素酶报告基因方法检测MGMC中lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p的结合能力;qRT-PCR检测单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、纤维蛋白(Fn)和胶原蛋白Ⅳ(Col.Ⅳ)的表达水平,流式细胞术和细胞计数试剂盒(CCK8)方法测定细胞增殖能力。

结果:在高糖培养下,MGMC中miR-7214-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。在低糖组中,沉默miR-7214-3p后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平升高,系膜细胞增殖能力增强(P<0.05);在高糖组中,过表达 miR-7214-3p后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平降低,系膜细胞增殖能力减弱(P<0.05)。MGMC过表达lncRNA-Gm4419后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平升高,系膜细胞增殖能力增强(P<0.05);同时过表达lncRNA-Gm4419和miR-7214-3p组较单独过表达lncRNA-Gm4419组,MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平降低,系膜细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论:在高糖条件下,lncRNA-Gm4419通过抑制 miR-7214-3p的表达来促进系膜细胞的炎症反应、纤维化形成和增殖。

关键词 长链非编码RNA   lncRNA-Gm4419   miR-7214-3p   肾小球系膜细胞

ABSTRACT

Objective:To investigate the effects of lncRNA-Gm4419 binding with miR-7214-3p on inflammation,fibrosis,and proliferation in mouse glomerular mesangial cells (MGMCs) under high glucose conditions. 

Methodology:The expression of miR-7214-3p in MGMCs cultured in low glucose (5.5mmol/L glucose + 19.5mmol/L mannitol) and high glucose (25mmol/L glucose) conditions was measured using qRT-PCR.The binding site of lncRNA-Gm4419 to miR-7214-3p was predicted by bioinformatics analysis.The binding ability of lncRNA-Gm4419 to miR-7214-3p in MGMCs was determined using the Luciferase reporter gene method.Additionally,the expression of monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1),tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin-1 beta (IL-1β),fibronectin (Fn),and type Ⅳ collagen (Col.Ⅳ) was assessed by qRT-PCR,and cell proliferation was evaluated using flow cytometry and Cell Counting Kit-8 (CCK8) assays. 

Results:MiR-7214-3p expression significantly decreased in MGMCs cultured in high glucose.In the low glucose group,silencing miR-7214-3p led to increased expression of MCP-1,TNF-α,IL-1β,Fn,and Col.Ⅳ,as well as enhanced cell proliferation.Conversely,in the high glucose group,overexpression of miR-7214-3p resulted in decreased expression of MCP-1,TNF-α,IL-1β,Fn,and Col.Ⅳ,as well as decreased cell proliferation.Furthermore,overexpression of lncRNA-Gm4419 in MGMCs led to increased expression of MCP-1,TNF-α,IL-1β,Fn,and Col.Ⅳ,and enhanced cell proliferation.However compared to overexpression of lncRNA-Gm4419 alone,when both lncRNA-Gm4419 and miR-7214-3p were overexpressed,the expression of MCP-1,TNF-α,IL-1β,Fn,and Col.Ⅳ decreased,along with reduced cell proliferation. 

Conclusion:Under high glucose conditions,lncRNA-Gm4419 promote the inflammatory response,fibrosis,and proliferation of MGMCs by inhibiting the expression of miR-7214-3p.

Key words long non-coding RNA   lncRNA-Gm4419   miR-7214-3p   glomerular mesangial cells

细胞、试剂及仪器  MGMC(SV40MES13)购自中科院细胞库,改良杜氏细胞培养基(DMEM)培养基购自(GE Healthcare Life Sciences,Logan,UT),胎牛血清购自翌圣生物,细胞计数试剂盒购自索莱宝,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝,双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自(Promega,Madison,WI),Trizo 试剂、RIPA 裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、电化学发光(ECL) 液购自(GE Healthcare,Chicago,IL,USA),Lipofectamine2000与 Trizol购自(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific,Inc.),反转录试剂盒与荧光定量 PCR 试剂盒购自(Takara,Kyoto,Japan),miR-7214-3p寡核酸模拟物及抑制剂、阴性对照物购自GenePharma,pcDNA3.1 购自(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific,Inc.),设计所有序列、引物的设计合成均由上海生工完成。

方法

细胞培养与分组  为了进行细胞培养实验,将MGMC培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,培养条件为37 ℃、5% CO2,待细胞在80%融合时进行传代培养,使用胰酶进行消化,然后将取对数期肾小球系膜细胞重悬后接种于96孔板中,细胞生长至70%融合时,使用含有5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇的培养基培养细胞作为低糖组,使用25 mmol/L高糖处理肾小球系膜细胞,记作高糖组。

按照《Lipofectamine2000试剂说明书》的要求,将阴性miRNA抑制物和miR-7214-3p抑制物分别转染至MGMC并使用低糖培养基培养细胞24 h,分别记作低糖+阴性miRNA抑制物组、低糖+miR-7214-3p抑制物组。将阴性miRNA类似物、miR-7214-3p类似物、空载体+阴性miRNA类似物、lncRNA-Gm4419+阴性miRNA类似物和lncRNA-Gm4419+miR-7214-3p类似物转染至MGMC使用高糖培养基培养细胞24 h,分别记作高糖+阴性miRNA类似物组、高糖+miR-7214-3p类似物组、高糖+空载体+阴性miRNA类似物组、高糖+Gm4419+阴性miRNA类似物组和高糖+Gm4419+miR-7214-3p类似物转染组。(miR-7214-3p类似物5'-CUCAGUCCUGACCCCUUGAGCGCA-3',miR-7214-3p抑制物 5'-ACGCGAGUUCCCCAGUCCUGACUC-3',阴性miRNA类似物/抑制剂5'-ACGCGAGUUCCCC AGUCCUGACUC-3')。

将各组细胞用脂质体进行转染,按照1∶3的量加入脂质体,轻轻吹打混匀后,与细胞共同培养5 h。然后补充新鲜培养液继续培养48 h。结束后用qRT-PCR法检测转染的效率,确定转染成功后方可用于后续实验研究。若转染效率未达到要求则重复上述转染,直至转染成功。

qRT-PCR实验 为了检测细胞的相对表达量,需要进行qRT-PCR实验。需要检测的细胞提取总RNA,然后将其转录为cDNA,并按照qPCR试剂盒要求检测模板中的miR-7214-3p、纤维蛋白(Fn)、胶原蛋白Ⅳ(Col.Ⅳ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达。以GAPDH、U6作为内参,采用2Ct法检测miR-7214-3p、MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ的相对表达量。引物信息如下:miR-7214-3p上游引物:5'-CTCAGTCCTGACCCCT TG-3',下游引物:5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3';Fn上游引物:5'-ATGAGAAGCCTGGATCCCCT-3',下游引物:5'-GGCCCGGAACATGAGGATAG-3';Col.Ⅳ上游引物:5'-AACAACGTCTGCAACTTCG-3',下游引物:5'-GCAGAGGCGAGCATCATAGT-3';TNF-α上游引物:5'-ATGGCCTCCCTCTCATCAGT-3',下游引物:5'-ACCCTGAGCCATAATCCCCT-3';IL-1β上游引物:5'-GTGGCAGCTACCTGTGTCTT-3',下游引物:5'-CTCTGCTTGTGAGGTGCTGA-3';MCP-1上游引物:5'-AGCCAACTCTCACTGAAGCC-3',下游引物:5'-GCATCACAGTCCGAGTCACA-3'。将cDNA作为模板进行qRT-PCR反应。参照试剂盒配置反应体系,反应条件如下:95 ℃预变性60 s,95 ℃变性60 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环。

双荧光素酶报告基因实验  通过使用在线预测网站miRDB-CustomPrediction,预测lncRNA-Gm4419和miR-7214-3p之间的靶向结合位点。提取MGMCs总RNA,逆转录为cDNA,通过lncRNA-Gm4419引物扩增出lncRNA-Gm4419全长序列,用Bam HI和Eco RV双酶切连接在pcDNA3.1真核表达质粒,产物转化感受态细胞DH5α,涂板、挑菌并摇菌扩增后,获得表达载体。制作lncRNA-Gm4419上游引物5'-GGGGATCCGGCTTTCGACCTCCGAGGCTGCGAC-3'和下游引物5'-TTGATATCACAACATTTGTGGTAGA GGTTAAACGGATATC-3'。然后,将lncRNA-Gm4419全长序列5'第348位碱基A突变为碱基T,合成含有lncRNA-Gm4419结合位点的基因片段(突变型lncRNA-Gm4419)和含有突变的lncRNA-Gm4419结合位点的基因片段(野生型lncRNA-Gm4419)。根据Lipofectamine2000转染试剂说明书,将lncRNA-Gm4419野生型质粒或突变型质粒与阴性miRNA类似物、miR-7214-3p核酸类似物、阴性miRNA抑制物和miR-7214-3p抑制物一起转染,培养48 h后加入裂解液进行裂解,4℃,12 000 r/min离心10 min,取上清检测海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性,并用二者的比值表示lncRNA-Gm4419和miR-7214-3p之间的结合能力。

流式细胞术  收集各组对数期MGMCs,用预冷PBS洗涤3次。接着加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞。将Annexin V-FITC和PI各5 μL滴入每个孔中并充分混匀。避光在室温下孵化20 min。使用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞增殖率。

CCK-8实验  将需要检测的细胞调整至104个/mL,按照CCK-8试剂盒要求进行操作,取约1×103个细胞,加入10 μL的CCK-8反应液。在490 nm波长下检测细胞的吸光度。细胞的增殖率为(OD490样本/OD490对照-1)×100%。

统计学方法  采用《GraphPad Prism 8.0》统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。使用独立样本t检验比较两组间差异,采用单因素方差分析比较多组差异,并用Tukey′s两两比较校正方法,P<0.05为差异有统计学意义。

在高糖诱导下,MGMC中miR-7214-3p表达下调  

与低糖组相比,高糖组中MGMC miR-7214-3p的表达显著降低,表明高糖条件可抑制MGMC中miR-7214-3p的表达(图2)。

图2 MiR-7214-3p在小鼠肾小球系膜细胞中表达情况

MGMC中lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p的相互结合 

沉默miR-7214-3p后,与野生型lncRNA-Gm4419共转染组相比,突变型lncRNA-Gm4419共转染组荧光素酶活性显著减少(P<0.05);过表达miR-7214-3p后,与野生型lncRNA-Gm4419共转染组相比,突变型lncRNA-Gm4419共转染组荧光素酶活性显著增加(P<0.05);表明miR-7214-3p可以与lncRNA-Gm4419结合(图3)。

图3 双荧光素酶活性检测lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p的结合力

WT Gm4419:野生型lncRNA-Gm4419; Mut Gm4419:突变型lncRNA-Gm4419;NC:阴性对照

MiR-7214-3p能够抑制MGMCs的炎症、纤维化和增殖   

在低糖条件下,与阴性miRNA抑制物组相比,miR-7214-3p抑制物组MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平和细胞增殖率显著升高(P<0.05);在高糖条件下,与阴性miRNA类似物相比,miR-7214-3p类似物组MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平和细胞增殖率显著减低(P<0.05)(图4)。表明miR-7214-3p能够抑制高糖诱导的MGMCs的炎症、纤维化和增殖。

图4 MiR-7214-3p对小鼠肾小球系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响

A:单核细胞趋化蛋白1(MCP-1);B:肿瘤坏死因子α(TNF-α);C:白细胞介素1β(IL-1β);D:纤维蛋白(Fn);E:胶原蛋白Ⅳ(Col.Ⅳ);F:细胞增殖的吸光度;G:S期(%);高糖+miR-7214-3p类似物组与高糖+阴性miRNA类似物组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001;低糖+miR-7214-3p抑制物组与低糖+阴性miRNA抑制物组相比,#:P<0.05,##:P<0.01,###:P<0.001

高糖培养环境下lncRNA-Gm4419通过miR-7214-3p调节炎症、纤维化和细胞增殖 

MGMC在高糖培养环境下,与空载体组相比,转染lncRNA-Gm4419组中MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平和细胞增殖率显著升高(P<0.05);转染lncRNA-Gm4419的同时过表达miR-7214-3p,MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平和细胞增殖率较单纯转染lncRNA-Gm4419组显著降低(图5)。结合前面的研究结果,lncRNA-Gm4419可与miR-7214-3p结合,提示lncRNA-Gm4419可通过调控miR-7214-3p来影响MGMC的炎症、纤维化和增殖。

图5 在高糖培养条件下,转染lncRNA-Gm4419后,观察过表达miR-7214-3p对小鼠肾小球系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响

A:单核细胞趋化蛋白1(MCP-1);B:肿瘤坏死因子α(TNF-α);C:白细胞介素1β(IL-1β);D:纤维蛋白(Fn);E:胶原蛋白Ⅳ(Col.Ⅳ);F:细胞增殖的吸光度;G:S期(%);Gm4419+ miR-7214-3p类似物组与Gm4419+阴性miRNA类似物组相比,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001;Gm4419+阴性miRNA类似物组与空载体+阴性miRNA类似物组相比,#:P<0.05,##:P<0.01,###:P<0.001

来源：肾脏病与透析肾移植杂志订阅号