作者：东部战区总医院 国家肾脏疾病临床医学研究中心 刘志红

刘志红院士在中华医学会肾脏病学分会第二十八届学术年会上分享了题为《狼疮肾炎致病基因解析及临床转化》的精彩报告

系统性红斑狼疮（SLE）是一种高度异质性的自身免疫性疾病，狼疮肾炎（LN）则是SLE十分常见和严重的合并症之一，其中约12%的患者将于10年内发展至终末期肾病。尽管近年来针对LN免疫发病机制靶向生物制剂的应用为LN患者带来了新的选择，但LN治疗完全缓解率仍停留在20%~45%，且复发率高。面对LN这一发病机制复杂，临床高度异质性的疾病，从解析致病基因及发病机制入手，进而揭示疾病发生的细胞分子基础，在明确核心通路和关键效应靶点的基础上，开展精准治疗干预，有望在LN的诊治上取得新的突破。下面将以我们近期发表在《自然》（Nature）杂志上的工作，分享我们在上述问题上进行的探索和发现。

细胞内核酸感知通路在抵御外来病原体、修复组织损伤中发挥关键作用。定位于内体中的Toll样受体7（TLR7）和9（TLR9）是感知RNA和DNA的核心分子，对系统性红斑狼疮的发病至关重要。在浆细胞样树突状细胞（pDCs）中，TLR7和TLR9通路的激活会促使细胞释放大量干扰素，进而促进自身抗原提呈和炎症反应发生，在B细胞中，这两条通路的激活则会诱导细胞产生大量抗核酸自身抗体，推动系统性红斑狼疮的发展。

磷脂酶D家族成员4（PLD4）在树突状细胞、单核细胞和B细胞中高表达。其作为一种定位于内溶酶体的5’核酸外切酶，能够切割单链RNA和单链DNA，从而限制TLR7和TLR9的过度激活。Pld4基因敲除小鼠会出现一系列自身免疫表型，包括体重减轻、脾脏肿大、自身抗体增加和免疫复合物沉积自身免疫表型，但PLD4基因突变导致的人类疾病尚未见报道。

通过对大型狼疮肾炎家系队列的筛选，在5个家系的5例狼疮肾炎患者中均鉴定到PLD4双等位基因突变，且所有突变都定位于PLD4蛋白催化结构域，均被预测为罕见变异和有害变异。虽然这些突变在空间上并不聚集于单一结构域，但结构预测表明它们可能通过影响氢键形成或底物结合等不同机制，进而损害外切酶活性。

研究发现携带PLD4基因功能缺失性突变患者外周血单个核细胞（PBMCs）中I型干扰素、NF-κB等炎症信号通路显著激活，并伴多种炎症细胞因子表达升高。单细胞转录组测序证实PLD4特异性表达于DCs细胞中，相应地，I型干扰素以及TLR7/TLR9通路相关基因、炎症细胞因子及趋化因子水平在PLD4特异性表达的DCs细胞中升高也最为显著。此外携带PLD4基因功能缺失性突变患者DCs细胞中TLR7/TLR9及其下游的I型干扰素通路呈现显著激活状态，提示PLD4缺陷可能通过影响DCs细胞功能引发患者系统性炎症和自身免疫反应。

核酸外切酶活性测定发现，携带PLD4突变患者来源细胞、突变的PLD4蛋白及过表达PLD4突变质粒的HEK293T细胞中核酸外切酶活性均显著降低，对内体-溶酶体内单链核酸底物的降解能力下降。患者PBMC中TLR7的全长和其激活形式均上调，表明TLR7/TLR9信号通路的被异常激活，同时伴下游炎症信号传导，如I型干扰素和MAPK通路激活。此外，与健康对照及不携带PLD4变异的SLE患者相比，PLD4基因突变的患者PBMC在TLR9激动剂刺激下表现出更强的炎症应答。在PLD4缺陷的THP-1细胞系中同样观察到炎症信号通路上调及对CpG-DNA的反应增强。研究结果表明TLR7/TLR9通路是PLD4功能缺失调控的关键信号通路。

既往研究显示在Pld3^-/-/Pld4^-/-双敲除小鼠模型中STING依赖性信号传导被激活，并且PLD3缺乏会诱导线粒体DNA的溶酶体积累，并渗漏至胞质，从而触发cGAS-STING通路激活和随后的炎症反应。我们的研究发现PLD4敲除的细胞系中STING的磷酸化和炎症信号通路显著增强，而STING特异性抑制剂则能有效地减弱PLD4缺乏诱导的I型干扰素等炎症信号激活。该结果表明STING通路是PLD4功能缺失调控的另一关键信号通路。

为揭示PLD4基因功能缺失性突变导致SLE的致病机制及其主要效应免疫细胞群，我们构建了Pld4基因敲除小鼠模型。结果显示，Pld4缺陷小鼠表现出典型的狼疮样表型，包括体重减轻、脾肿大、自身抗体升高及肾脏免疫复合物沉积等。多组织炎症分析显示，肾脏是Pld4缺陷受累最显著的器官，组织病理损伤最重，且炎症因子及干扰素刺激基因（ISGs）表达升高最显著，这与人类患者狼疮肾炎表型高度一致。进一步观察发现Pld4基因敲除小鼠肾脏中不仅固有细胞炎症反应增强，还伴有大量免疫细胞浸润，尤其是pDCs及PCs显著增多。通过混合骨髓嵌合体小鼠模型，证实pDCs和PCs的异常扩增是PLD4基因缺陷的细胞内在作用，从而阐明了PLD4在维持免疫稳态中的关键作用。

基于患者与Pld4基因敲除小鼠模型中异常上调的I型干扰素信号通路，采用JAK抑制剂巴瑞替尼对Pld4缺陷小鼠进行了干预。结果显示，该治疗可显著缓解Pld4缺陷小鼠体重下降、脾肿大、自身抗体产生、免疫复合物沉积及组织炎症等自身免疫表型。进一步还发现巴瑞替尼在患者来源的PBMC中同样能有效抑制I型干扰素通路的过度激活，为携带PLD4基因功能缺失性突变的SLE患者提供了靶向治疗的重要依据。

我们发现PLD4基因功能缺失性突变导致人类LN。系统揭示了PLD4基因功能缺失性突变导致其核酸外切酶活性显著降低，激活TLR7/TLR9通路使其下游Ⅰ型干扰素的响应明显增强，驱动pDCs和PCs等免疫细胞扩增和活性增加，从而介导LN发生的机制。验证了JAK抑制剂在Pld4缺陷小鼠及患者来源的PBMC细胞均具有良好的治疗作用，为探索基于基因型的个体化治疗提供了依据。

我们的研究完整地展示了LN诊断和治疗：致病基因—效应细胞—核心通路—靶向干预的全景图，为进一步攻克SLE这类复杂疾病提供了新的路径和范式。