摘 要 目的:探讨粪菌16sRNA高通量测序联合血清白蛋白(Alb)对腹膜透析(PD)患者快速型腹膜溶质转运系数(PSTR)的预测价值。方法:纳入国家肾脏疾病临床医学研究中心回顾性患者队列(2004年1月至2024年1月)和前瞻性患者队列(2024年5月至2024年10月)。两个队列患者均根据置管后30 d首次腹膜平衡试验(PET)透出液肌酐和血清肌酐浓度比值(D/Pcr)将患者分为非快速型PSTR组[进一步分为低转运组(D/Pcr≤0.49)和低平均转运组(D/Pcr 0.50～0.64)]和快速型PSTR组(D/Pcr≥0.65),以多因素Logistic回归及受试者工作特征曲线(ROC)分析Alb预测快速型PSTR的能力,并以David提出的含性别、种族、Alb、钠参数的PSTR经验公式进行Alb预测能力的外部验证。前瞻性队列收集置管后30 d行首次PET时粪便标本,-80 ℃冻存后统一完成粪菌16sRNA高通量测序,比较患者肠道菌群水平的差异,分析差异菌属联合Alb对快速型PSTR的判别价值。结果:回顾性队列共纳入1008例PD患者,其中快速型PSTR组占比26.9%。Logistic回归分析提示,与快速型PSTR独立相关的变量包括收缩压、血尿酸和Alb;与其他变量相比,Alb水平判定快速型PSTR的ROC曲线下面积最大,且Alb预测能力与David公式差异无统计学意义[AUC 95%CI 0.636 (0.593～0.680) vs 0.629 (0.589～0.670),P=0.480]。粪菌研究共纳入50例新入PD患者,低转运组,低平均转运组及快速型PSTR组在Alb水平差异具有统计学意义(P=0.012),三组间肠道菌群α多样性和β多样性差异均无统计学意义,菌群构成在门、纲、目、科水平差异均无统计学意义,但在属及种水平差异有统计学意义。瘤胃球菌属在低转运组相对丰度显著高于快速型PSTR组(P=0.018)。瘤胃球菌属水平相对丰度与D/Pcr水平呈负相关(r=-0.351,P=0.013)。DeLong检验显示,瘤胃球菌属水平相对丰度与Alb联合显著改善Alb判定快速型PSTR的预测价值[AUC 95%CI 0.871(0.733～0.979) vs 0.725(0.554～0.895),P=0.04];粪菌联合Alb预测能力也显著优于David公式[AUC 95%CI 0.668(0.475～0.860),P<0.001]。结论:Alb水平是PD患者腹膜溶质转运功能独立预测因子,粪菌16sRNA高通量测序得出的瘤胃球菌相对丰度与Alb联合可显著提高其判定快速型PSTR的预测价值。

关键词 腹膜透析 快速型腹膜溶质转运系数 肠道菌群 高通量测序

Fecal microbiota 16sRNA high-throughput sequencing combined with serum albumin for fast peritoneal solute transport rate prediction in peritoneal dialysis patients

ZHANGZhihong,ZHOUTingting,YUWenxin,ZHANGMan

NationalClinicalResearchCenterforKidneyDiseases,JinlingHospital,Nanjing210016,China

ABSTRACTObjective:To explore the predictive value of combining fecal microbiota 16sRNA high-throughput sequencing with serum albumin (Alb) for the fast peritoneal solute transport rate (PSTR) in PD patients.Methodology:In this center’s retrospective patient cohort (January 2004-January 2024),patients were divided into non-fast PSTR group and fast PSTR group based on the ratio of dialysate creatinine to serum creatinine from the first peritoneal equilibration test (PET) performed 30 days post-catheter insertion (D/Pcr=0.65).The ability of Alb to predict fast PSTR was analyzed using multivariate Logistic regression and receiver operating characteristic (ROC) analysis,and the external validation of Alb’s predictive capability was conducted using the PSTR empirical formula proposed by David,which includes parameters such as gender,race,Alb,and sodium.On the other hand,from May to October 2024,50 newly admitted PD patients were recruited,and the first PET was performed 30 days post-catheter insertion.Concurrently,fecal samples were collected,frozen at-80 ℃,and subsequently subjected to high-throughput sequencing of fecal 16S rRNA.Patients were classified into low transport group (D/Pcr≤0.49),low average transport group (D/Pcr 0.50-0.64),and fast PSTR group (D/Pcr≥0.65) based on the D/Pcr ratio.The differences in intestinal microbiota levels among the three groups were compared,and significant differential bacterial genera were identified using linear discriminant analysis,analyzing the discriminative value of differential genera combined with Alb for fast PSTR.Results:A retrospective cohort study included 1 008 patients with PD,among which the fast PSTR group accounted for 26.9%.Logistic regression analysis indicated that the variables independently associated with fast PSTR included systolic blood pressure,uric acid,Alb.Compared to other variables,the level of Alb had the largest area under the ROC curve for determining fast PSTR.The predictive ability of Alb was not statistically significantly different from that of the David formula[AUC 95%CI 0.636 (0.593-0.680) vs 0.629(0.589-0.670),P=0.480].The fecal microbiota study included 50 newly admitted PD patients,revealing statistically significant differences in Alb levels among the low transport group,low average transport group and fase PSTR group (P=0.012).However,there were no statistically significant differences in the α and β diversity of intestinal microbiota among the three groups.The composition of the microbiota showed no statistically significant differences at the phylum,class,order,and family levels,but significant differences were observed at the genus and species levels.Linear discriminant analysis revealed that the relative abundance of the genus Ruminococcus in the low transport group was significantly higher than that in the fast PSTR group (P=0.018).Correlation analysis indicated a negative correlation between the relative abundance of Ruminococcus and D/Pcr levels (r=-0.351,P=0.013).The DeLong test demonstrated that the relative abundance of Ruminococcus significantly improved the predictive value of Alb for fast PSTR determination[AUC 95%CI 0.871 (0.733-0.979) vs 0.725(0.554-0.895),P=0.04]; the predictive capability of fecal bacteria combined with Alb was also significantly superior to that of the David formula[AUC 95%CI 0.668(0.475-0.860),P<0.001]. Conclusion:Serum Alb levels are independent predictors of peritoneal solute transport function in patients with PD.The relative abundance of Ruminococcus species derived from fecal 16S rRNA high-throughput sequencing,when combined with Alb levels,can significantly enhance the predictive value of the latter in determining the fast PSTR.

Keywords  peritoneal dialysis   fast peritoneal solute transport rate   fecal microbiota   high-throughput sequencing

腹膜溶质转运功能是影响腹膜透析(PD)质量及患者预后的重要因素[1]。2021年国际腹膜透析协会(ISPD)发布的腹膜功能障碍分类评价指南归纳指出:(1)腹膜平衡试验(PET)是评价腹膜溶质转运功能的金标准;(2)计算腹膜溶质转运系数(PSTR)是PET最重要的内容之一,其数值在人群中为近似正态分布,快速型PSTR为第4 h末透出液和第2h末血清肌酐浓度比值(D/Pcr)高于人群均值,推荐值为0.65;(3)大样本队列研究显示快速型PSTR是患者全因死亡及再入院的独立危险因素[2]。既往研究指出,影响PSTR水平的相关因素包括尿毒症状态、PD疗程、腹膜炎、透析液高浓度葡萄糖及其降解产物[3-5]。对于新入PD治疗的患者,PD疗程、腹膜炎、透析液高浓度葡萄糖及其降解产物暴露因素近乎一致,初始PSTR水平与尿毒症个体间重要变量[如血清白蛋白(Alb)]的关系值得关注[6-8]。另一方面,近年来“脑肠轴”和“肠肾轴”的研究均提示粪菌生态在远隔器官损伤中的重要作用[9-10]。腹膜与肠道毗邻,肠道菌群或其代谢产物可能移位至循环或透析液,从而影响腹膜溶质转运功能。本研究利用粪菌16sRNA高通量测序技术,探索肠道菌群丰度差异与PSTR的相关性,并探讨其与Alb联合对快速型PSTR的预测价值。

研究对象分2个步骤纳入。(1)利用国家肾脏疾病临床医学研究中心回顾性PD患者队列,纳入2004年1月至2024年1月数据库成人PD患者。排除标准:高龄(年龄≥80岁)、恶性肿瘤、近期严重外伤或感染、急性肾损伤、肢体残缺、重度肥胖或消瘦[体质量指数(BMI)>30 kg/m2或<18 kg/m2]、全身组织严重水肿。(2)2024年5月至2024年10月按照上述标准招募50例新入PD患者。本研究通过东部战区总医院医学伦理审查(批准文号2022DZKY-103-01)。

记录患者人口信息与实验室检验结果。两个队列患者均于置管后30 d首次行PET,根据D/Pcr水平将患者分为非快速型PSTR组(D/Pcr<0.65)和快速型PSTR组(D/Pcr≥0.65)。非快速型PSTR组又进一步分为低转运组(D/Pcr≤0.49)与低平均转运组(D/Pcr 0.50～0.64)。此外收集同期连续性变量包括BMI,血红蛋白(Hb)、C反应蛋白(CRP)、Alb、总胆固醇(TC)、尿酸(UA)、钙、磷、钾、钠、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。计算总尿素清除指数(Kt/V)和残余肾小球滤过率(rGFR)。前瞻性队列50例新入PD患者,收集置管后30 d行首次PET时晨起粪便样本,置于粪便保存液中,-80℃冰箱保存。采用粪便DNA提取试剂盒提取DNA,提取样品总DNA后,根据保守区设计得到引物,在引物末端加上测序接头,进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库,质检合格的文库用Illumina NovaSeq 6000进行测序。

采用《SPSS 27.0》与《SigmaPlot 14》软件包进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差表示,偏态分布资料以中位数(四分位间距)表示,计数资料或等级资料以频数和频率表示。计量资料组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验,计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。对回顾性队列,分析低转运组,低平均转运组和快速型PSTR组三组间变量差异显著性,多因素有序分类Logistic回归分析与快速型PSTR独立相关的连续性变量,其中单变量入选标准P<0.20,并以受试者工作特征曲线(ROC)评价变量预测能力,其中特别关注Alb的预测价值,并以David等提出的PSTR经验公式(PSTR=0.028 858 3×性别+0.024 756×人种-0.008 145 2×血钠-0.008 296 7×Alb+2.136 475,其中男性与女性赋值1与0,白人与其他人种赋值1与0)进行Alb预测能力的外部验证[11]。在肠道菌群研究,比较三组患者粪菌差异,DeLong检验分析差异菌属联合Alb对快速型PSTR的判别价值。P<0.05为差异具有统计学意义。

回顾性队列共纳入1008例PD患者,男性530例(52.5%)。平均年龄为43.4±13.5岁,rGFR为5.03(3.25,7.32) mL/(min·1.73m2),总Kt/V为2.05±0.63,快速型PSTR占比26.9%。非快速型PSTR组与快速型PSTR组患者在年龄、性别、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、合并糖尿病比例、原发病慢性肾小球肾炎比例、Hb、Cr、UA、血钙、rGFR及Alb水平等差异均有统计学意义。对低转运组、低平均转运组及快速型PSTR组行三组间方差分析及LSD事后分析,提示仅SBP、UA、钙及Alb满足两两亚组间均存在显著性差异(均P<0.05)(表1)。

表1 回顾性腹膜透析队列临床资料

PSTR:腹膜溶质转运系数;P1值:低转运组、低平均转运组和快速型PSTR组三组间比较;P2值:非快速型PSTR组与快速型PSTR组比较

以快速型PSTR行单因素有序多分类Logistic回归显示,SBP、DBP、Hb、Cr、TC、UA、血钙、rGFR及Alb均符合多因素分析纳入标准,将上述指标纳入多因素有序多分类Logistic回归分析显示SBP、UA和Alb仍具有统计学意义(表2)。与其他变量相比,Alb水平判定快速型PSTR的ROC曲线下面积最大(表3);此外,DeLong检验提示Alb预测能力与David公式差异无统计学意义[AUC 95%CI 0.636 (0.593～0.680) vs 0.629(0.589～0.670),P=0.480]。

表2 回顾性腹膜透析队列快速型腹膜溶质转运系数相关因素有序Logistic回归分析

表3  回顾性腹膜透析队列快速型PSTR相关指标的AUC

PSTR:腹膜溶质转运系数;AUC:受试者工作特征曲线下面积

50例患者中男性31例(62%),平均年龄48.3±14.0岁,rGFR为4.65(3.34,7.54)mL/(min·1.73m2),总Kt/V为1.98±0.83,快速型PSTR共9例。非快速型PSTR组与快速型PSTR组Alb水平上差异有统计学意义(P=0.033),进一步三亚组间方差分析及LSD事后分析,提示Alb仍满足两两亚组间均存在显著性差异(表4)。

表4  粪菌研究腹膜透析患者临床资料

PSTR:腹膜溶质转运系数;P1值:低转运组、低平均转运组和快速型PSTR组三组间比较,P2值:非快速型PSTR组与快速型PSTR组比较

菌群α多样性与β多样性分析粪菌研究低转运组、低平均转运组和快速型PSTR组三组患者间菌群α多样性指标包括Ace指数、Chaol指数、Shannon指数和Simpson指数差异均无统计学意义;而Anosim箱型图与样品聚类热图显示三组间菌群β多样性差异也无统计学意义(图1、图2)。

图1 α多样性指数组间差异箱线图

PSTR:腹膜溶质转运系数;图示箱的上下端线代表四分位数(IQR),中位线代表中位数;上下边缘代表1.5倍IQR,在上下边缘的外部的点代表异常值;组1:快速型PSTR组;组2:低平均转运组;组3:低转运组

图2 Anosim箱型图与样品聚类热图

PSTR:腹膜溶质转运系数;组1:快速型PSTR组;组2:低平均转运组;组3:低转运组;以颜色梯度由蓝色到红色表示样品间Bray-Curtis距离由近到远

肠道菌群构成的丰度分析三组患者肠道菌群构成在门、纲、目、科水平差异均无统计学意义。三组患者肠道菌群构成在属水平及种水平比较相对丰度差异有统计学意义;其中种水平比较中瘤胃球菌、未分类的布劳特氏菌相对丰度差异有统计学意义。采用组间丰度柱状图显示瘤胃球菌属的亚群在低转运组显著高于快速型PSTR组(P=0.018)(图3)。

图3 三组间瘤胃球菌属水平相对丰度比较

PSTR:腹膜溶质转运系数;组1:快速型PSTR组;组2:低平均转运组;组3:低转运组;每组内横向实线与虚线分别标识瘤胃球菌属亚群的相对丰度平均值与中位值

PET检验项目与肠道菌群相对丰度的相关分析PET检验项目包括D/Pcr、第4 h与初始腹膜透析液葡萄糖浓度比值(D4h/D0)、净超滤量(NUF)分别与属水平丰度排序前10位菌种的相对丰度行相关分析,显示瘤胃球菌属水平相对丰度与D/Pcr水平呈负相关(Spearman相关系数r=-0.351,P=0.013),与NUF水平呈正相关(Spearman相关系数r=0.328,P=0.020);类似的,在种水平行相关分析,显示瘤胃球菌种水平相对丰度与NUF水平呈正相关(Spearman相关系数r=0.336,P=0.016)。

瘤胃球菌相对丰度与Alb联合判定快速型PSTR的预测价值 DeLong检验显示,瘤胃球菌属水平相对丰度与Alb联合显著改善Alb判定快速型PSTR的预测价值[AUC 95%CI 0.871(0.733～0.979) vs 0.725(0.554～0.895),P=0.04]。此外,粪菌联合Alb预测能力也显著优于David公式[AUC 95%CI 0.668(0.475～0.860),P<0.001](图4)。

图4 瘤胃球菌属水平相对丰度与Alb水平联合判定快速型PSTR的受试者工作特征曲线

PSTR:腹膜溶质转运系数;Alb:血清白蛋白

本研究以大样本的回顾性队列结合前瞻性探索发现Alb水平是腹膜溶质转运功能独立预测因子,粪菌16sRNA高通量测序得出的瘤胃球菌属水平相对丰度与Alb联合可显著提升判定快速型PSTR的预测价值。

PET直接测算PSTR是临床评估腹膜转运功能的主要手段,遗憾的是PET需待患者PD置管30 d后进行,且检测方法较为繁琐。迄今为止运用常规临床数据预测PSTR的效能仍然欠佳。美国一项纳入10142例PD患者的队列研究发现,包括人口学和临床指标的回归方程对PSTR水平的解释权重仅为8%,这些指标包括性别、年龄、肾脏原发病、合并症、rGFR与尿量[12]。另一项欧洲完成的队列研究,纳入2850例患者发现,包括人口学和临床参数拟合的回归方程解释PSTR水平差异的效能仅为5.4%,此外基因组限制性最大似然分析显示遗传在PSTR个体差异中的解释权重为19.3%[13]。血液生化指标是尿毒症患者常规检验项目,近期David等提出以Alb、血钠浓度指标结合性别、种族因素的PSTR经验公式。该研究共纳入712例患者,平均年龄为58.4岁,男性比例为60.5%,合并糖尿病比例为42.7%,PSTR均值为0.73;以AUC对该公式的内部评价为0.74(0.67～0.82)[11]。Alb是血浆中丰度最高的蛋白质,其半衰期长达15～21 d,既往大量研究提示Alb水平与PD患者预后包括全因死亡[6,14]、心血管事件[15]、腹膜炎风险[8,16]、技术失败风险[17]独立相关。在横断面水平,一些小样本的研究也提示Alb水平与PSTR亦存在显著相关性[18-19],但Alb水平预测快速型PSTR效能未见报道。本研究利用1008例PD患者队列资料发现,快速型PSTR判定的AUC比较,以Alb相对最高,Alb与David公式相比,预测快速型PSTR的效能差异无统计学意义,因而在大样本层面确认Alb对快速型PSTR的独立预测价值。除Alb外,利用质谱分析技术,血浆中可以鉴定出高达1051种蛋白质,其中α酸性糖蛋白、CRP[20]和白细胞介素6[21]也被发现与快速型PSTR有关,但三者皆为炎症急性相蛋白,半衰期较短,且血浆丰度远低于Alb,其应用价值可能更多用于辅助Alb的预测能力。

本研究在回顾性队列中Alb判定快速型PSTR的AUC为0.636,从临床实践需求出发仍需进一步改进。已知肠道菌群的失衡与多种疾病有关,肠道菌群高通量测序可准确描述受检者的肠道微生态结构及多样性,预测相关疾病的发生风险。本研究在粪菌前瞻性队列中发现,瘤胃球菌属水平相对丰度与D/Pcr水平呈负相关,而与NUF水平呈正相关,相关系数均>0.3;进一步以其相对丰度联合Alb水平发现可显著提升判定快速型PSTR的能力。本研究的发现提示瘤胃球菌丰度变化可能在“肠道-腹膜轴”(Gut-Peritoneum Axis)机制中发挥一定作用[22]。瘤胃球菌是一类革兰氏阳性、严格厌氧的细菌,主要存在于肠道中,已知作用是分解宿主消化系统的纤维素,发酵葡萄糖和木糖,帮助稳定肠道屏障。在PD患者中发现瘤胃球菌丰度下降与认知障碍风险及腹膜Kt/V水平呈正相关[23-24],与肠源性毒素硫酸对甲酚血清水平呈负相关[25]。本研究的发现进一步提示肠道微生态的多样性与腹膜溶质转运能力的相关线索,为后续进一步研究打下基础。

既往研究提示,PSTR水平与患者预后之间呈现类似上升抛物线的函数关系[1]。本研究在回顾性队列将患者根据PSTR水平由低到高进行三分组,期望能从三组中找出类似趋势的连续性变量。经过递进分析,作者认为Alb可做为预测PSTR的候选指标。在粪菌研究队列,尽管纳入患者数量不多,但Alb水平在快速型PSTR组、低平均转运组及低转运组三个亚组间亦呈现类似由低到高上升趋势。因而,本研究从回顾性队列与前瞻性队列中均观察到Alb水平与PSTR水平间的联动关系。最后,需要说明的是,本研究利用大样本的回顾性队列明确Alb对快速型PSTR的独立预测价值,并以David公式[11]给予外部验证,首创前瞻性探索肠道微生态的多样性与腹膜溶质转运能力的相关性。但本研究仍存在一定局限性,其为单中心研究,患者来源可能存在偏倚,此外,粪菌探索性研究样本量较少,导致AUC置信区间较宽泛。

小结:Alb水平是PD患者腹膜溶质转运功能独立预测因子,粪菌16sRNA高通量测序得出的瘤胃球菌素相对丰度与Alb联合可显著提升判定快速型PSTR的预测价值。